Revista Cienfica, FCV-LUZ / Vol. XXXV Recibido: 19/06/2025 Aceptado: 04/09/2025 Publicado: 09/10/2025 UNIVERSIDAD DEL ZULIA Serbiluz Sistema de Servicios Bibliotecarios y de Información Biblioteca Digital Repositorio Académico 1 of 5 Revista Cienfica, FCV-LUZ / Vol. XXXV https://doi.org/10.52973/rcfcv-e35728 UNIVERSIDAD DEL ZULIA Serbiluz Sistema de Servicios Bibliotecarios y de Información Biblioteca Digital Repositorio Académico Caracterización molecular de Mycoplasmosis felina en gatos atendidos en un consultorio del suburbio de la ciudad de Guayaquil, Ecuador, 2024. Molecular characterizaon of feline Mycoplasmosis in cats treated at a clinic in the suburbs of Guayaquil, Ecuador, 2024. Briggitte Dennisse Carrillo-Chuquitarco¹* , Georgia Mendoza-Castañeda² , María del Carmen Zambrano-Guerra² , Pablo Torres-Lasso² , Liliana Irene Cercado-Malavé³ , Cristhian Neptalí Macías-García³ Universidad Técnica de Machala-Fac. Ciencias Agropecuaria ¹ s, Ecuador. idad de Guayaquil-Fac. Medicina Veterinaria y Z ² Univers ootecnia, Ecuador. ³ Investigadores-Revisores Independientes, Ecuador. *Autor correspondencia: dcarrillo6@utmachala.edu.ec RESUMEN La micoplasmosis felina ha ganado relevancia en la Medicina Veterinaria, debido a su capacidad de afectar gravemente a los gatos doméscos, compromeendo su estado hematológico y aumentando el riesgo de anemia severa; además, pueden presentar manifestaciones clínicas como: letargo, anorexia, y mucosas pálidas, en ocasiones dicil de diagnoscar por métodos tradicionales. El presente estudio se desarrolló en un consultorio veterinario de la ciudad de Guayaquil- Ecuador, con el objevo de caracterizar la micoplasmosis felina mediante técnicas moleculares y evaluar la efecvidad diagnósca del fros sanguíneo frente a la Reacción en Cadena de la Polimerasa. Se tomaron muestras sanguíneas de 20 gatos, que fueron clínicamente compables a micoplasmosis, dando como resultado, 8 (40%) posivos y 12 (60%) negavos por PCR. Además, la especie más prevalente fue Candidatus Mycoplasma haemominutum (35%), seguida de Candidatus Mycoplasma turicensis (15%) y Candidatus Mycoplasma haemofelis (10%). El fros sanguíneo mostró baja sensibilidad (25%) pero alta especificidad (91,7%) en comparación con la técnica molecular. Asimismo, se observó una mayor proporción de casos posivos en gatos adultos y con bajo peso corporal, aunque con diferencias estadíscas no significavas. Los resultados rafican la importancia del diagnósco molecular en gatos con presunta micoplasmosis. El presente trabajo invesgavo, aporta evidencia local sobre la circulación de Micoplasmosis felina, destacando la necesidad de adoptar herramientas precisas para su detección, por cuanto, favorece a la toma de decisiones terapéucas y al control de esta enfermedad. Palabras claves: Micoplasmosis felina; Mycoplasma haemofelis; diagnósco molecular; PCR; gatos doméscos ABSTRACT Feline mycoplasmosis has gained relevance in Veterinary Medicine due to its ability to severely affect domesc cats, compromising their hematological status and increasing the risk of severe anemia. Addionally, clinical signs such as lethargy, anorexia, and pale mucous membranes may be present, which are somemes difficult to diagnose using tradional methods. This study was conducted in a veterinary clinic in Guayaquil, Ecuador, with the aim of characterizing feline mycoplasmosis through molecular techniques and evaluang the diagnosc effecveness of blood smear compared to Polymerase Chain Reacon. Blood samples were collected from 20 cats with clinical signs compable with mycoplasmosis, resulng in 8 (40%) PCR-posive cases and 12 (60%) PCR-negave cases. Moreover, the most prevalent species was Candidatus Mycoplasma haemominutum (35%), followed by Candidatus Mycoplasma turicensis (15%) and Candidatus Mycoplasma haemofelis (10%). The blood smear showed low sensivity (25%) but high specificity (91.7%) compared to the molecular technique. Likewise, a higher proporon of posive cases was observed in adult cats and those with low body weight, although the differences were not stascally significant. The results confirm the importance of molecular diagnoscs in cats suspected of having mycoplasmosis. This research provides local evidence of Mycoplasma circulaon in felines, highlighng the need to adopt accurate detecon tools to support therapeuc decision-making and disease control. Key words: Feline mycoplasmosis; Mycoplasma haemofelis; molecular diagnosis; PCR; domesc cats

Revista Cienfica, FCV-LUZ / Vol. XXXV UNIVERSIDAD DEL ZULIA Serbiluz Sistema de Servicios Bibliotecarios y de Información Biblioteca Digital Repositorio Académico INTRODUCCIÓN Los micoplasmas comúnmente llamados hemoplasmas, son bacterias con un tropismo específico por los eritrocitos en diversas especies de mamíferos, incluidos los felinos doméscos (Felis catus) [1 ,[2]. Estas bacterias se caracterizan por adherirse a la membrana de los glóbulos rojos, alterando su estabilidad estructural y funcional, ocasionando la aparición de anemia hemolíca e incluso la muerte del animal. Las principales especies idenficadas en gatos son: Candidatus Mycoplasma haemofelis, Candidatus Mycoplasma haemominutum, Candidatus Mycoplasma turicencis [3]. La transmisión de los hemoplasmas en felinos ocurre principalmente a través de vectores hematófagos como la pulga (Ctenocephalides felis). Sin embargo, también se han reportado otras vías de contagio incluyendo, mordeduras y transfusiones sanguíneas. Además, los gatos que presentan coinfección con retrovirus como el virus de la Leucemia Felina (FeLV) o el virus de la inmunodeficiencia Felina (VIF), presentan un riesgo significavamente mayor al desarrollar complicaciones graves, tales como: anemia severa y disfunción de médula ósea [4 , 5 , 6]. El cuadro clínico asociado a la micoplasmosis felina se caracteriza por la presencia de letargo, anorexia, fiebre, mucosas pálidas o ictéricas, taquicardia y taquipnea [7]. En etapas avanzadas de la enfermedad, es frecuente observar esplenomegalia, linfadenopatía y manifestaciones clínicas asociadas a inmunosupresión, especialmente en gatos coinfectados con el FeLV y el VIF [8 , 9]. Cabe destacar que, algunos felinos pueden actuar como portadores asintomácos, lo que complica el diagnósco clínico cuando se basa exclusivamente en la evaluación de los signos clínicos visibles [8]. El diagnósco de la micoplasmosis ha mejorado notablemente con el avance de las técnicas moleculares. Los métodos tradicionales como la citología presentan baja sensibilidad y especificidad, especialmente en casos de bacteriemia leve [10 , 11]. En contraste, la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), se ha consolidado en una herramienta esencial para la detección precisa de las especies involucradas de Mycoplasmas [12]. En Ecuador, si bien existen estudios que han idenficado a Candidatus Mycoplasma haemofelis, mediante técnicas moleculares [1 ,[10], aún no se ha documentado con suficiente profundidad la presencia de otras especies como: Candidatus Mycoplasma haemominutum y Candidatus Mycoplasma turicencis. Esto evidencia un vacío en la literatura cienfica nacional y la necesidad de invesgaciones epidemiológicas a nivel nacional. [12] El tratamiento de la micoplasmosis felina se basa principalmente en la administración de doxiciclina considerada el anbióco de primera elección por su alta eficacia. Además, debe complementarse con fluidoterapia y transfusiones sanguíneas en casos de anemia severa [13]. El objevo principal de este estudio fue determinar la prevalencia de tres especies de Mycoplasmas, a través de la idenficación molecular en gatos, atendidos en un consultorio Veterinario de la ciudad de Guayaquil, Ecuador, comparando la sensibilidad y especificidad del fros sanguíneo con la técnica de PCR. MATERIALES Y MÉTODOS El presente estudio es descripvo, explicavo y transversal, de po no experimental; el muestreo se llevó a cabo entre octubre y diciembre de 2024, durante este periodo se recolectaron muestras sanguíneas de 20 gatos, atendidos en un consultorio Veterinario de la ciudad de Guayaquil-Ecuador. Los gatos fueron seleccionados mediante un muestreo no probabilísco por conveniencia. El tamaño de la muestra fue limitado debido a restricciones económica. Esta limitación fue considerada durante el diseño del estudio, el cual se planteó como un estudio preliminar con fines descripvos, orientado a idenficar que especies de Mycoplasmas se encuentran presentes en gatos clínicamente sospechosos en esta área geográfica. Se incluyeron únicamente aquellos pacientes que presentaban signos clínicos compables con micoplasmosis felina, tales como; letargia, mucosas pálidas, anorexia, fiebre y pérdida de peso (balanza Growns B12H, China) La variable dependiente fue la presencia o ausencia de Mycoplasma. En las variables independientes se tomó en cuenta la edad y el Índice de Masa Corporal (IMC). Cabe recalcar que, tanto fros como PCR, fueron realizados en base a los diagnóscos posivos a micoplasmosis considerando que algunos gatos estuvieron coinfectados por varias especies de Mycoplasma. Toma de muestras y análisis de laboratorio Sumando a esto se obtuvo muestras de sangre periférica (1 mL) mediante punción de la vena safena, ulizando una aguja mariposa de calibre 21 G x 3/4. Luego, se procedió a depositar directamente en tubos de tapa lila, que conenen el ancoagulante EDTA (ácido etilendiaminotetraacético). Posteriormente, las muestras fueron remidas al laboratorio especializado DIAGNOVET (Guayaquil, Ecuador), el cual cuenta con cerficación de la Agencia de Sanidad Animal del Ecuador (AGROCALIDAD), para su análisis correspondiente. La siguiente información técnica, incluyendo las caracteríscas de los kits y los protocolos de amplificación, fue facilitada por el laboratorio especializado DIAGNOVET. En el microscópico (OMAX M837FLR, China) se analizaron las muestras de fros sanguíneos teñidos con la técnica Wright- Giemsa. Esta nción uliza colorantes como azul de meleno y eosina para resaltar la morfología celular. La observación se realizó mediante microscopía ópca con objevo de inmersión (1000x), permiendo evaluar estructuras compables con hemopatógenos. Para el diagnósco molecular, se ulizó la técnica de PCR isotérmica (iiPCR), empleando kits comerciales POCKIT™ 2 of 5

Caracterización molecular de Mycoplasmosis felina / Carrillo-Chuquitarco y cols. UNIVERSIDAD DEL ZULIA Serbiluz Sistema de Servicios Bibliotecarios y de Información Biblioteca Digital Repositorio Académico (GeneReach Biotechnology Corp., Taiwán), específicos para Mycoplasma haemofelis, Candidatus Mycoplasma haemominutum y Candidatus Mycoplasma turicensis. Estos Kits están diseñados para detectar secuencias del gen 16SrRNA mediante sondas fluorescentes. La extracción de ADN se realizó con el sistema automazado PEN- Aid™ Nucleic Acid Co-Prep Kit, y la amplificación se llevó a cabo en el analizador de ácidos nucleicos (POCKIT,serie Micro POCKIT, Taiwan) que manene una temperatura constante de 52° C. La detección se basa en la fluorescencia a 520 nm, con interpretación digital automáca en pantalla. Cada ensayo incluyó controles posivos y negavos suministrados por el fabricante. La sensibilidad reportada fue de 10 copias de ADN por reacción. Dado que este método no requiere electroforesis en gel, no se generaron imágenes de bandas, como ocurre en la PCR convencionales. Esta metodología permió idenficar la presencia de Candidatus Mycoplasma haemofelis en 2 muestras, Candidatus Mycoplasma haemominutum en varias muestras y Candidatus Mycoplasma turicensis en algunos casos adicionales. Análisis estadísco Los datos obtenidos de los pacientes fueron registrados por medio del programa incorporado Excel, dentro de una base de datos elaborada con las siguientes variables: nombre del paciente, grupo etario, resultados PCR, resultado por po de Mycoplasmas, resultados de fros sanguíneo, y peso corporal. Posteriormente, se realizó el análisis estadísco ulizando el soſtware SPSS. Se aplicó la prueba de chi-cuadrado de Pearson para evaluar si exisa una asociación entre variables como el grupo etario y el peso corporal con la posividad a micoplasmosis, no encontrándose asociación entre las mismas (p > 0.05). Además, se ulizó una tabla de conngencia de 2x2 para comparar los resultados obtenidos por las técnicas de diagnósco (PCR vs. fros sanguíneo), lo que permió evaluar el grado de sensibilidad y de especificidad del fros frente a la prueba GOLD que es la PCR. RESULTADOS Y DISCUSIÓN La prevalencia de Mycoplasma spp. fue del 40 % posivos y 60% resultó negavo a la prueba PCR. Estos datos, reflejan que la infección por micoplasmosis está presente en un porcentaje considerable de la población felina atendida en el consultorio (TABLA I). TABLA I Prevalencia de Mycoplasma spp. en gatos detectadas por PCR Frecuencia % Posivo 8 40% Negavo 12 60% Total 20 100% * Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) Se reportó una prevalencia del 55% mediante PCR convencional [14], mientras que, en Rumania [15] y Colombia [16] en sus resultados obtuvieron 21,6 y 24,4% respecvamente, ambos ulizando PCR en empo real (qPCR), indicando así, que la tasa de infección puede variar según los siguientes factores: variabilidad geográfica, el po de población felina estudiada, condiciones climácas que influyen en la presencia de vectores, y las técnicas diagnóscas empleadas. Tanto la qPCR y la PCR convencional, poseen diferentes sensibilidad y especificidad respecto a la iiPCR ulizada en el presente estudio. Se logró determinar la presencia de tres especies principales de Mycoplasmas, la más frecuente fue Candidatus Mycoplasma haemominutum, detectada con el 35%, asimismo, Candidatus Mycoplasma turicencis se idenficó con el 15% de los gatos, mientras que, Candidatus Mycoplasma haemofelis fue detectada con el 10%, considerada la más patógena, pero la menos frecuente (TABLA II). TABLA II Frecuencia de especies de Mycoplasma felina en gatos atendidos en un consultorio del suburbio de la ciudad de Guayaquil detectadas por PCR Frecuencia % Candidatus Mycoplasma haemominutum 7 35,0% Candidatus Mycoplasma turicencis 3 15,0% Candidatus Mycoplasma haemofelis 2 15,0% Nota: Frecuencia calculada en base a la población total de gatos (N=20) Se reportó el 63,6% de frecuencia para, Candidatus Mycoplasma haemominutum [17], mientras que, en otro estudio se obtuvo el 3,4 % para la misma especie [3], siendo en ambos casos la más frecuente y coincidiendo con los datos de esta invesgación. Por otro lado, un estudio adicional presentó una baja frecuencia del 10%, correspondiente a Candidatus Mycoplasma haemofelis [15], valor que coincide en el presente estudio. Sin embargo, las proporciones varían entre estudios, posiblemente debido a diferencias en los cebadores empleados, el número de ciclos de amplificación o el protocolo de extracción de ADN. Asimismo, se idenficaron frecuencias igualmente bajas para Candidatus Mycoplasma turicensis en dos estudios disntos, con valores de 1,2% y 0,9 % respecvamente [3 , 17]. Al comparar ambas técnicas mediante una tabla de conngencia, se observó que, de los 8 (40%) gatos posivos por PCR, solo 2 fueron detectados por fros sanguíneo, lo que indica una sensibilidad del 25% para esta úlma técnica. Por otro lado, de los 12 (60%) gatos negavos por PCR, 11 resultaron negavos en el fros, lo que corresponde a una especificidad del 91.7%, evidenciando que el fros sanguíneo presenta una baja sensibilidad, pero una alta especificidad en comparación con la PCR (TABLA III). 3 of 5

Revista Cienfica, FCV-LUZ / Vol. XXXV UNIVERSIDAD DEL ZULIA Serbiluz Sistema de Servicios Bibliotecarios y de Información Biblioteca Digital Repositorio Académico TABLA III Comparación de métodos diagnóscos (fros vs. PCR) para Mycoplasma spp. en sangre felina Fros sanguíneo *PCR Posivo *PCR Negavo Total Posivo 2 (25%) 1 (8.3%) 3 Negavo 6 (75%) 11 (91.7%) 17 Total 8 12 20 * Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) El fros sanguíneo convencional mostró una menor detección de Mycoplasma en comparación con PCR, lo que concuerda con reportes previos que atribuyen esta limitación a su baja sensibilidad frente a cargas parasitarias reducidas y a la adherencia irregular del patógeno a los eritrocitos [17]. De acuerdo con el análisis del grupo etario, se obtuvo lo siguiente: en cachorros y gerontes no se presentaron casos posivos, en gatos jóvenes el porcentaje fue del 28,6% y en adultos el 60% posivos. De este modo, se indica que la presencia de micoplasmosis, se presentó en los grupos etarios de gatos jóvenes y adultos (TABLA IV). TABLA IV Relación entre el grupo etario y la frecuencia de micoplasmosis Grupo Etario Posivo Negavo Cachorro 0(0,0%) 1(100%) Joven 2(28,6%) 5(71,4%) Adulto Geronte 6(60%) 0(0.0%) 4(40%) 2(100%) *No se encontró asociación estadíscamente significava entre el grupo etario y la presencia de micoplasmosis (P > 0.05) En el presente estudio, la posividad a micoplasmosis en gatos jóvenes (28,6%) fue notablemente inferior a la reportada previamente (75%) [14]. Por el contrario, en gatos adultos se registró una mayor frecuencia (60%) en comparación con los valores descritos en la literatura (8,0% y 52%) [3 ,[14]. Estos resultados sugieren variaciones en la distribución etaria de la infección, posiblemente asociadas a diferencias poblacionales o epidemiológicas. Finalmente, entre el peso y la presencia de micoplasmosis mostró lo siguiente: el 71,44% de los gatos con peso bajo resultaron posivos, mientras que, el 28,6% fueron negavos. Los gatos con peso normal, el 23,1% fueron posivos, y el 76,9% fueron negavos. Por lo tanto, descripvamente nos indican que los gatos con peso bajo enen una mayor probabilidad de infectarse de micoplasmosis, en comparación con los gatos de peso normal (Tabla V). TABLA V Relación entre el peso corporal y la frecuencia de micoplasmosis Peso Posivo Negavo Peso bajo 5(71,4%) 2(28,6%) Peso normal 3(23,1%) 10(76,9%) *No se evidenció asociación estadíscamente entre el peso corporal y la presencia de micoplasmosis (P > 0.05) Un estudio realizado Ibagué-Colombia reportó varios gatos posivos a micoplasmosis, presentando signos clínicos compables, entre ellos la pérdida de peso, lo que concuerda con el presente estudio, donde sugiere que los animales con bajo peso pueden llegar a ser más suscepble a la infección [10]. CONCLUSIÓN Se evidenció que los gatos están siendo infectados por Mycoplasmas, entre los cuales Candidatus Mycoplasma haemominutum como la especie predominante, seguida por Candidatus Mycoplasma turicensis y Candidatus Mycoplasma haemofelis, considerada la más patógena, pero la menos frecuente. Por su parte, la técnica de fros sanguíneo presentó baja sensibilidad en comparación con la PCR posicionándose como una herramienta diagnósca precisa para la detección de casos clínicos y subclínicos de micoplasmosis. En cuanto a las variables de edad e Índice de masa corporal, no se encontró asociación estadíscamente significava, lo que sugiere que estos factores no estarían relacionados con la presencia de la enfermedad en esta población de gatos estudiada. Cabe señalar que, en conjunto, los resultados confirman la presencia de los tres Mycoplasmas principales en la población estudiada, algunos coinfectados con más de una especie, lo que evidencia una circulación acva y simultánea de estos patógenos. Estos hallazgos destacan la importancia de la caracterización molecular como herramienta diagnósca fundamental. Conflictos de intereses Los autores cerfican que no existe conflicto de intereses en la presente invesgación. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS [1] Pérez Macchi S, Villalba M, Sepúlveda García P, Villagra V, Maldonado E, Brítez L. Diagnosco y análisis filogenético de la infección natural por Mycoplasma spp en felinos doméscos. Compend. Cienc. Vet. [Internet]. 2023 [Consultado 20 Ene 2025]; 13(2):11–7. Disponible en: hps://goo.su/UuzHYw 4 of 5

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