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______________________________________________________ Revista Cientíca, FCV-LUZ / Vol. XXXIII, Supl. Esp., 279 - 291, 2023
Establecimiento exitoso de poblaciones de células
clonales editadas con genoma basado en CRISPR
a partir de células primarias de búfalo, cabra y oveja
Priyanka Singh, Bosco Jose, Devika Gautam,
Aseem Tara, Shreya Malhotra, Sacchinandan De,
Manoj K. Singh, Naresh L. Selokar*
División de Biotecnología Animal (ABTD), ICAR-Instituto
Nacional de Investigación Láctea, Karnal, Haryana, 132001,
India
*Autor de correspondencia: Naresh L. Selokar (naresh.selokar@icar.gov.in).
RESUMEN
La tecnología de edición del genoma tiene un gran po-
tencial para la modicación precisa del ADN en células de ma-
míferos. La capacidad de generar con precisión la población
clonal del genotipo editado con CRISPR es de gran importancia
en el análisis de la función/vía genética, el descubrimiento de
fármacos y la producción de animales con genoma editados. En
el presente estudio, demostramos un método eciente para ge-
nerar poblaciones clonales unicelulares de animales de granja
editadas con CRISPR, incluidos búfalos, cabras y ovejas. Para
generar poblaciones de células clonales, los broblastos prima-
rios se establecieron mediante cultivo de explante y luego se
sometieron a electroporación con CRISPR/Cas RNP dirigidas
al gen MSTN alterado. Utilizamos un método de recogida de
una sola célula en el que se recogió una célula utilizando un ca-
pilar de vidrio ultrano y se transrió a cada pocillo de una placa
de 96 pocillos. Para promover el crecimiento de células indivi-
duales, utilizamos medios suplementados con factor de creci-
miento. Después de sembrar una única célula en cada pocillo,
la placa se mantuvo en reposo durante 5 a 7 días y luego se
anotaron las tasas de unión de las células. Informamos que las
tasas de unión celular para las células de búfalo, cabra y oveja
fueron del 40%, 77,08% y 83,67%, respectivamente. Las ta-
Successful establishment of CRISPR-based ge-
nome-edited clonal cell populations from prima-
ry cells of bualo, goats, and sheep
Priyanka Singh, Bosco Jose, Devika Gautam,
Aseem Tara, Shreya Malhotra, Sacchinandan De,
Manoj K. Singh, Naresh L. Selokar*
Animal Biotechnology Division (ABTD), ICAR-National Dairy
Research Institute, Karnal, Haryana, 132001, India
*Corresponding author: Naresh L. Selokar (naresh.selokar@icar.gov.in)
ABSTRACT
Genome editing technology has great potential for pre-
cise DNA modication in mammalian cells. The ability to pre-
cisely generate the clonal population of CRISPR-edited geno-
type is of great importance in gene function/pathway analysis,
drug discovery, and production of genome-edited animals. In
the present study, we demonstrated an ecient method to
generate CRISPR-edited single-cell clonal populations of farm
animals, including bualo, goats, and sheep. To generate clon-
al cell populations, the primary broblasts were established
through explant culture and then electroporated with CRISPR/
Cas RNPs targeted for the disrupted MSTN gene. We used
a single-cell pickup method in which one cell was picked up
using an ultra-ned glass capillary and transferred into each
well of a 96-well plate. For promoting the growth of single cells,
we used growth factor-supplemented media. After seeding a
single cell to each well, the plate was kept undisturbed for 5-7
days, and then cell attachment rates were noted. We reported
that the cell attachment rates for bualo, goat, and sheep cells
were 40%, 77.08%, and 83.67%, respectively. The proliferation
rates were 70.83%, 75.67%, and 78.05% for bualo, goat, and
sheep cells, respectively. We noticed that cell attachment and
proliferation rates were better in the case of goat and sheep
cells; also, these cells exhibited less vacuolation compared to
BOT-117 Rev. Cientif. FCV-LUZ, XXXIII, SE, 281-282, 2023, https://doi.org/10.52973/rcfcv-wbc125
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13th World Bualo Congress ~ 13er Congreso Mundial de Búfalos / Posters / Biotechnology & Omics Technologies ____________________
bualo cells. In the present study, we generated 11, 20, and
20 single-cell clones of MSTN-gene-edited bualo, goat, and
sheep cells. In conclusion, our method can be eciently used
to generate genome-edited single-cell clones to harness the
potential of CRISPR technologies in farm animals.
Keywords: CRISPR, single cell, clonal population, ge-
nome-editing, farm animals.
sas de proliferación fueron del 70,83%, 75,67% y 78,05% para
las células de búfalo, cabra y oveja, respectivamente. Notamos
que las tasas de proliferación y unión celular eran mejores en
el caso de las células de cabra y oveja; además, estas células
exhibieron menos vacuolización en comparación con las célu-
las de búfalo. En el presente estudio, generamos 11, 20 y 20
clones unicelulares de células de búfalo, cabra y oveja editadas
con el gen MSTN (miostatina). En conclusión, nuestro método
se puede utilizar de manera eciente para generar clones uni-
celulares con genoma editados para aprovechar el potencial de
las tecnologías CRISPR en animales de granja.
Palabras clave: CRISPR, células unicelulares, población clo-
nal, edición del genoma, animales de granja.
