Producción de embriones en etapa de blastocisto

con desactivación del gen β-lactoglobulina (BLG)

de búfalo de agua indio utilizando tecnología CRIS-

PR y SCNT

Aseem Tara, Priyanka Singh, Devika Gautam,

Gaurav Tripathi, Shreya Malhotra, Sacchinandan De,

En varios países tropicales, la leche de búfala tiene una

demanda de mayor valor que la leche de vaca debido a su va-

lor nutricional y económico. En la India, la búfala es el principal

animal lechero y aporta el 45% del total de leche producida

en el país. Además del valor nutricional de la leche, se han

informado varias proteínas alergénicas como la caseína, la

α-lactoalbúmina, la β-lactoglobulina (BLG) y las inmunoglobu-

linas. Las estrategias de reproducción, el manejo nutricional y

la genética cuantitativa han mejorado la producción de leche,

pero estos enfoques no han podido conducir a cambios signi-

β-lactoglobulina de búfala (BLG) y así producir leche hipoaler-

génica a largo plazo. Para lograr nuestros objetivos, diseñamos

tres guías de ARN de guía única (sgRNA) dirigidos al locus

BLG en búfalos. Posteriormente, evaluamos su eciencia de

edición mediante una combinación de secuenciación Sanger,

seguida de análisis TIDE e ICE. Entre los tres sgRNA, se utilizó

el sgRNA más eciente para generar la población clonal de cé-

lulas editadas. Se establecieron y seleccionaron varios clones

unicelulares utilizando los métodos de clonación TA (también

Production of β-lactoglobulin (BLG) gene knock-

Research Institute, Karnal, Haryana, 132001, India

*Corresponding author: Selokar, Naresh (naresh.selokar@icar.gov.in).

In several tropical countries, bu󰀨alo milk has a higher-val-

ue demand than cow milk due to its nutritional and economic

value. In India, the bu󰀨alo is the main dairy animal and con-

tributes 45% of the total milk produced in the country. Besides

the nutritional value of milk, several allergen proteins such as

casein, α-lactalbumin, β-lactoglobulin (BLG), and immunoglob-

ulins have been reported. Breeding strategies, nutritional man-

we planned to utilize the CRISPR tools to disrupt the bu󰀨alo

β-lactoglobulin (BLG) gene to produce hypoallergenic milk in

the long run. In pursuit of our objectives, we designed three

single guide RNAs (sgRNAs) targeting the BLG locus in bu󰀨a-

lo. Subsequently, we assessed their editing e󰀩ciency through a

combination of Sanger sequencing, followed by TIDE and ICE

analysis. Among three sgRNAs, the most e󰀩cient sgRNA was

used to generate the clonal population of edited cells. Several

single-cell clones were established and screened using the TA

cloning (also known as rapid cloning or T cloning) and Sanger

The cloned blastocyst production rates (25 to 30%) were sim-

ilar to non-edited control cells. E󰀨orts are ongoing to establish

pregnancies from BLG-KO cloned embryos. This work can lead

to the generation of designer bu󰀨aloes to produce hypoaller-

genic milk for human benet.

Keywords: bu󰀨alo, milk allergy, β-lactoglobulin, CRISPR,

conocida como clonación rápida o clonación T) y secuencia-

ción de Sanger. De los 14 clones unicelulares analizados, se

encontró que ocho tenían eventos de alteración del gen BLG

(tasas de edición del 57%). Utilizando transferencia nuclear de

células somáticas (SCNT), producimos con éxito embriones

clonados en etapa de blastocisto a partir de 4 células clonales

alteradas por el gen BLG. Las tasas de producción de blasto-

cistos clonados (25 a 30%) fueron similares a las de las célu-