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______________________________________________________ Revista Cientíca, FCV-LUZ / Vol. XXXIII, Supl. Esp., 240 - 278, 2023
Un primer estudio sobre sexado de espermatozoi-
des en búfalos de agua mediante nanopartículas
magnéticas
Syed Murtaza Hassan Andrabi*,
Muhammad Hammad Fayyaz, Muhammad Shaq Haider,
Ghulam Muhammad Ali
Programa de Genética y Reproducción Animal, Instituto
de Ciencias Animales, Centro Nacional de Investigación
Agrícola, PARC, Islamabad 44000, Pakistán
*Autor de correspondencia: Andrabi, Syed Murtaza Hassan
(andrabi123@yahoo.com)
RESUMEN
La preselección de sexo en ganadería es una herramien-
ta genética de importancia económica, ya que permite a los
criadores de animales producir progenie de sexo especíco,
aumentando así la rentabilidad y la ganancia genética en la
industria ganadera. Es preferible un mayor porcentaje de ter-
neras para la producción lechera. En Pakistán, los búfalos de
agua se crían principalmente con nes lácteos. Por lo tanto,
este estudio fue diseñado para optimizar la técnica de sexado
de semen basada en nanopartículas magnéticas (MNP) en bú-
falos de agua. Se reunieron muestras de semen calicadas de
A rst study on sperm sexing in water bualo
through magnetic nanoparticles
Syed Murtaza Hassan Andrabi*,
Muhammad Hammad Fayyaz, Muhammad Shaq Haider,
Ghulam Muhammad Ali
Animal Reproduction and Genetics Program, Animal
Sciences Institute, National Agricultural Research Centre,
PARC, Islamabad 44000, Pakistan
*Corresponding author: Andrabi, Syed Murtaza Hassan
(andrabi123@yahoo.com)
ABSTRACT
Gender pre-selection is a genetic tool of economic sig-
nicance, as it permits animal breeders to produce sex-spe-
cic progeny, thereby increasing protability and genetic gain
in the livestock industry. A higher percentage of female calves
is preferable for dairy production. In Pakistan, water bualos
are primarily kept for dairy purposes. Therefore, this study
was designed to optimize the magnetic nanoparticles (MNPs)
based sperm sexing technique in water bualo. Qualied se-
men samples from ve bualo bulls were pooled and divided
into four aliquots. Each aliquot of 50 million sperm was dilut-
ed in 1 mL of modied human tubal uid (mHTF). Three ali-
R-221 Rev. Cientif. FCV-LUZ, XXXIII, SE, 269-270, 2023, https://doi.org/10.52973/rcfcv-wbc116
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13th World Bualo Congress ~ 13er Congreso Mundial de Búfalos / Posters / Reproduction _______________________________________
quots (sexed groups) were incubated with 0.67 ml of negatively
charged MNPs suspension. The fourth aliquot was incubated
without MNPs (called “control group”). Each tube containing
sperm-MNPs suspension was slowly shaken for 5 minutes for
uniform mixing. The MNPs were negatively charged and (pro-
vided by Clemente Associates Inc, Prescott, Arizona, USA)
had a diameter of 50 nanometers. The interaction between
the negative charge of MNPs and the Z electrical potential of
spermatozoa was dierent for those spermatozoa carrying an
X chromosome (-20 mV) and those carrying a Y chromosome
(-16 mV). Therefore, the Y chromosome-bearing spermatozoa
remained closer to MNPs. Three sexed groups were exposed
to a magnet for 10, 20, and 30 minutes. The control group was
exposed to the magnet for 20 minutes. Consequently, in the
sexed groups, the Y-bearing sperm-MNP complexes remained
attached to the tube’s inner wall due to the magnetic force. In
contrast, the X-chromosome spermatozoa remained suspend-
ed in the medium. Then, suspended spermatozoa carrying the
X chromosome were slowly aspirated. The control group was
also aspirated and transferred to a new tube. After aspiration,
each group’s progressive motility (PM, %) of spermatozoa
was assessed through a computer-assisted sperm analyzer
(CASA). After that, spermatozoa were centrifuged at 226 × g
for 5 minutes to remove the mHTF, and DNA was extracted.
Validation of the sexing technique was done through SYBR®
Green Real-Time (RT) PCR using two sets of primers for gen-
der-specic genes, i.e., X-linked proteolipid protein (PLP) and
sex-determining region Y protein (SRY). Results revealed that
PM was similar (p>0.05) in all groups (ranging from 62 to 65%).
The mean fold expression of the PLP gene (X chromosome
bearing sperm) was higher (p<0.05) in all sexed groups (av-
erage: 15.34-fold = 91.09% X chromosome bearing sperm)
as compared to control (1.60-fold). In conclusion, the MNPs-
based technique appeared to be an eective method for water
bualo sperm sexing as validated by RT PCR.
Keywords: bualo sperm, sperm sexing, magnetic nanoparti-
cles, Real-Time PCR.
cinco búfalos reproductores y se dividieron en cuatro alícuotas.
Cada alícuota de 50 millones de espermatozoides se diluyó
en 1 ml de líquido tubárico humano modicado (mHTF). Se
incubaron tres alícuotas (grupos sexados) con 0,67 ml de sus-
pensión de MNP cargada negativamente. La cuarta alícuota se
incubó sin MNP (llamada “grupo de control”). Cada tubo que
contenía suspensión de esperma-MNP se agitó lentamente du-
rante 5 minutos para una mezcla uniforme. Los MNP estaban
cargados negativamente y (proporcionados por Clemente As-
sociates Inc, Prescott, Arizona, EE. UU.) y tenían un diámetro
de 50 nanómetros. La interacción entre la carga negativa de
las MNP y el potencial eléctrico Z de los espermatozoides fue
diferente para aquellos espermatozoides que portan un cromo-
soma X (-20 mV) y aquellos que portan un cromosoma Y (-16
mV). Por lo tanto, los espermatozoides portadores del cromo-
soma Y permanecieron más cerca de las MNP. Se expusieron
tres grupos sexados a un imán durante 10, 20 y 30 minutos. El
grupo de control estuvo expuesto al imán durante 20 minutos.
En consecuencia, en los grupos sexados, los complejos es-
permatozoide-MNP con carga cromosómica Y permanecieron
adheridos a la pared interna del tubo debido a la fuerza mag-
nética. Por el contrario, los espermatozoides del cromosoma X
permanecieron suspendidos en el medio. Luego, se aspiraron
lentamente los espermatozoides suspendidos que portaban
el cromosoma X. El grupo de control también fue aspirado y
transferido a un tubo nuevo. Después de la aspiración, se eva-
luó la motilidad progresiva (PM, %) de los espermatozoides de
cada grupo mediante un analizador de esperma asistido por
computadora (CASA). Después de eso, los espermatozoides
se centrifugaron a 226 × g durante 5 minutos para eliminar el
mHTF y se extrajo el ADN. La validación de la técnica de sexa-
do se realizó mediante PCR en tiempo real (RT-PCR) SYBR®
Green utilizando dos conjuntos de cebadores para genes es-
pecícos de género, es decir, proteína proteolípida ligada al
cromosoma X (PLP) y proteína de la región Y determinante
del sexo (SRY). Los resultados revelaron que la MP fue similar
(p>0,05) en todos los grupos (entre 62 y 65%). La expresión
media del gen PLP (esperma con cromosoma X) fue mayor
(p<0,05) en todos los grupos sexados (promedio: 15,34 veces
= 91,09% de esperma con cromosoma X) en comparación con
el control (1,60 veces). En conclusión, la técnica basada en
MNP mostró ser un método ecaz para el sexado de semen de
búfalo de agua, validado por RT PCR.
Palabras clave: semen de búfalo, sexado de espermatozoi-
des, nanopartículas magnéticas, RT PCR.
