https://doi.org/10.52973/rcfcv-e34499
Recibido: 05/08/2024 Aceptado: 12/10/2024 Publicado: 29/12/2024
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Revista Científica, FCV-LUZ / Vol. XXXIV, rcfcv-e34499
RESUMEN
Las enfermedades bacterianas son responsables de grandes
pérdidas económicas en la acuicultura en todo el mundo, y las ranas
son susceptibles a las bacterias Gram negativas causantes de la
septicemia. Este estudio registra las características bioquímicas,
moleculares y patológicas de la infección por Citrobacter freundii
y Edwardsiella tarda en hembras reproductoras de rana toro (Rana
catesbeiana). Para el diagnóstico bacteriológico se utilizaron
reproductoras clínicamente enfermas con letargo, anorexia, piel
pálida, lesiones macroscópicas de hemorragia en patas traseras,
distensión abdominal y parte superior de las ancas. Se obtuvieron
dos aislados bacterianos de hígado, se caracterizaron como bacilos
Gram negativos, catalasa positivos y oxidasa negativos. Se realizó
un ensayo experimental para conrmar los postulados de Koch.
Los aislados de hígado del bioensayo (postulados de Koch), RcM1
(R. catesbeiana Muestra 1) y RcM2 (R. catesbeiana Muestra 2) fueron
sometidos a identicación bioquímica mediante un API comercial 20E
y molecular, utilizando la secuenciación del genoma completo. Las
muestras presentaron perl bioquímico y molecular correspondiente
a C. freundii y E. tarda. Por histopatología de los organismos iniciales
y del experimento presentaron severa inltración de eritrocitos,
trombocitos, formación de nódulos con aglomerados bacterianos en
el centro, inltración de broblastos rodeando al nódulo, manchas
negras, (melanocitos) multifocal, necrosis multifocal y pérdida de la
estructura original en riñón, bazo, hígado e intestino.
Palabras clave: Ranicultura; reproductoras; distensión abdominal;
hemorragia
ABSTRACT
Bacterial diseases are responsible for the majority of global economic
losses in aquaculture production worldwide, and frogs are susceptible
to Gram–negative bacteria that cause septicemia. This study records
the biochemical and molecular characteristics and pathological
effects of Citrobacter freundii and Edwardsiella tarda infection in
breeding female bullfrogs (Rana catesbeiana). For the bacteriological
diagnosis, clinically ill breeders with lethargy, anorexia, pale skin,
macroscopic hemorrhage lesions on the hind legs, abdominal
distension and upper part of the haunches were used. Two bacterial
isolates were obtained from the liver, they were characterized as
Gram negative, catalase positive and oxidase negative bacilli. An
experimental test was carried out Koch’s postulates to conrm.
The liver isolates from the bioassay (Koch’s postulates), RcM1
(R. catesbeiana Muestra 1) y RcM2 (R. catesbeiana Muestra 2) were
subjected to biochemical identication by a commercial API 20E and
molecular using whole genome sequencing. The samples presented
a biochemical and molecular prole corresponding to C. freundii
and E. tarda. histopathology analysis of the initial organisms and
the experiment, they showed severe inltration of erythrocytes,
thrombocytes, formation of nodules with bacterial agglomerates
in the center, inltration of broblasts surrounding the nodule,
multifocal black spots (melanocytes), multifocal necrosis and loss
of normal structure in bullfrogs internal organs, such as the liver,
kidney, spleen and intestine.
Key words: Frog farming; broodstock; abdominal distension;
hemorrhage
Estudio molecular e histopatológico de la infección por Citrobacter freundii
y Edwardsiella tarda en reproductoras de rana toro (Rana catesbeiana)
Molecular and histopathological study of Citrobacter freundii and Edwardsiella tarda infection in
bullfrog (Rana catesbeiana) broodstock
María Soledad Morales–Covarrubias
1
* , Blanca Alicia Ramírez–Azpilcueta
1
, María del Carmen Bolán–Mejía
1
, Julissa Enciso–Ibarra
1
,
Frida Stephania Silva–Alonso
2
, Bruno Gómez–Gil
1
, Noemí García–Aguilar
1
1
Unidad Mazatlán en Acuicultura y Manejo Ambiental. Mazatlán, Sinaloa, México.
2
Universidad Tecnológica de Guadalajara. Colonia La Aurora, Guadalajara, Jalisco.
*Corresponding author: marisol@ciad.mx
A
B
C
D
FIGURA 1. A: Rana toro (Rana catesbeiana) con piel pálida. B: Lesiones
macroscópicas de hemorragia en patas traseras (echa azul). C: Expansión
en abdomen y parte superior de las ancas (echa roja). D: Presencia de
líquido ascítico (echa lila) en la región abdominal al realizar la disección.
Inflamación en intestino (flecha roja), hígado (flecha–amarilla) y bazo
(echa–azul) con presencia de nódulos blanquecinos (echas verdes) solo
en hígado y bazo de distribución multifocal
Infección bacteriana en reproductoras de rana toro / Morales-Covarrubias y cols.__________________________________________________
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INTRODUCCIÓN
El género Citrobacter está formado por bacterias gramnegativas,
aeróbicas facultativas, con forma de bastón y no formadoras de
esporas que pertenece a la familia Enterobacteriaceae [1]. Se pueden
encontrar abundantemente en los recursos hídricos naturales, aguas
residuales, suelo, alimentos en polvo, muestras de orina y materia
fecal [2, 3]. Se han reportado un total de 19 especies de Citrobacter.
Entre las diferentes especies de Citrobacter, C. freundii tiene cepas
patógenas para animales y humano. Se han documentado infecciones
por C. freundii en animales terrestres domésticos, cautivos y salvajes,
anbios, diversas especies de tortugas, mamíferos acuáticos y peces
de piscifactoría [1]. C. freundii normalmente se considera un patógeno
oportunista en peces, actuando como un invasor secundario. En
condiciones adversas como estrés ambiental o inmunodeciencia,
puede ser un patógeno primario [4].
Edwardsiella tarda, bacteria gramnegativa, anaerobia facultativa
y móvil por agelación perítrica, causa infecciones intestinales y
extraintestinales. Se encuentra en aguas dulces y marinas. La vía de
transmisión puede ser directamente el agua o a través de la ingestión
de animales acuáticos mal cocinados. La virulencia de esta bacteria
está ligada a la producción de hemolisinas y su habilidad para invadir
las células del intestino. E. tarda, ha sido reportada como causante de
alta mortalidad en el pez Oscar (Astronotus ocellatus) con alteraciones
en hígado y bazo [5].
La acuicultura es actualmente uno de los sectores de producción de
alimentos de más rápido crecimiento en el mundo y se ha consolidado
como un recurso para apoyar la seguridad nutricional de miles de
millones de personas mediante el complemento de la fuente de proteína
animal. En México, la producción intensiva de rana toro es una de las
actividades acuícolas que ha tomado mayor relevancia, debido a su
creciente demanda interna y a la exportación de animales destinados
al mercado gourmet (alimentación), investigación y docencia [6].
En la Sierra Central Mexicana (Aguascalientes, Querétaro, Jalisco
y Zacatecas), la producción exportable de rana toro en 2015 fue de
20 toneladas, mientras que en 2016 y 2017 la producción aumentó de
23,5 a 26 toneladas, respectivamente [7].
Las ranas pueden convertirse en hospedadores intermedios
o denitivos de diversas especies de bacterias, los cuales están
estrechamente relacionados con su dieta, hábitat, sistema de
producción, bioseguridad y número de individuos [8]. Las bacterias
pueden afectar negativamente el desarrollo y la salud de los animales
[9, 10]. Sin embargo, a pesar de la aparición común de bacterias
en anbios, existen pocos estudios que indiquen su prevalencia y
distribución [9, 11]. Además, los productores acuícolas de rana toro
han establecido diversas estrategias para su cría, estableciendo
principalmente unidades de producción intensivas con alta
concentración de animales; donde se controla el crecimiento, la
reproducción, la temperatura y el ambiente con el n de mejorar los
parámetros productivos [7] y con ello el aumento de enfermedades.
Debido a la importancia que está adquiriendo la ranicultura para
obtención de carne, así como también las mortalidades presentadas
con signología recurrente en reproductoras, acompañado en algunas
ocasiones con variaciones de temperatura ambiental en el ranario
CIAD–Mazatlán en mayo del 2021, el objetivo de este estudio fue
identicar los agentes causales de las mortalidades presentadas
en reproductoras de Rana catesbeiana.
MATERIAL Y MÉTODOS
Declaración de ética
El manejo de los organismos se realizó siguiendo el Manual de
buenas Prácticas de Producción Acuícola de rana toro de Servicio
Nacional de Sanidad, Inocuidad y Calidad Agroalimentaria 02 de
noviembre de 2016 [12].
Toma de muestras y aislados bacterianos
Se recolectaron cinco hembras de rana toro, con un peso promedio
de 512 ± 4 g (Báscula–BOECO–27054141–made in USA) por cada
muestreo (abril del 2016 y mayo del 2021), de la sala de reproductores
del CIAD–Mazatlán que presentaban letargo, anorexia, piel pálida,
lesiones macroscópicas de hemorragia en patas traseras (FIG. 1),
expansión en abdomen y parte superior de las ancas. Al realizar la
disección, se observó líquido ascítico en región abdominal, hígado,
bazo e intestino inamado con nódulos blanquecinos multifocal
(FIG.1). Los especímenes fueron sacricados con un golpe seco
en el área anterodorsal [12] para luego realizar la disección
asépticamente de hígado, bazo, riñón e intestino, tomando muestras
para bacteriología, análisis metagenómico e histopatología.
Bacteriología
Se tomaron 0,5 g de hígado, intestino, bazo y riñón, para ser
homogeneizadas en 1,0 mL de agua estéril. Se realizaron tres
diluciones con suero siológico y se sembró 0,1mL en TSA (Agar
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tripticasa soya– Difco, BD) y Agar sangre por período de incubación
de 24 h a 30°C (VWR Scientic, 1565, USA).
Para el aislamiento de bacterias, se tomaron muestras de
colonias aisladas y fueron sembradas en TSA incubándose a 30°C
(VWR Scientic, 1565, USA) durante 24 h. Una vez obtenidos los
aislados fueron sometidos a tinción de Gram, prueba de oxidasa y
catalasa e identicación bioquímica mediante un kit comercial API
20E (BioMérieux, Francia), de acuerdo con las especicaciones del
fabricante. Para análisis posteriores las muestras puricadas fueron
conservadas a -80°C (Panasonic–U53VA–PA. USA) en crioviales con
caldo tripticasa soya (Difco, BD) y 10 % de glicerol (PROMEGA).
Inoculo bacteriano
La suspensión bacteriana se realizó tomando un inóculo de cada
cepa y resuspendiéndola en suero siológico estéril (NaCl al 0,85 %).
Las suspensiones bacterianas se ajustaron a una concentración de
1×10
8
UFC mL
-1
, equivalente a 0,5 del estándar MacFarland [13]. Para
conocer la concentración real del inóculo se hicieron 6 diluciones y
se sembraron las 2 últimas en TSA. Para el bioensayo experimental
se tomaron 50 µL de la suspensión stock y se resuspendieron en 2
mL, de suero siológico, de esa dilución se inyectaron a las ranas
300 µL por vía intramuscular.
Extracción de ADN
Se utilizó el kit Promega (Wizard Genomic DNA Purication Kit)
para extraer el ADN genómico de los aislados bacterianos siguiendo
la metodología descrita por el fabricante, tomando pequeños trozos
(0,5 g) para realizar el macerado de hígado, intestino, bazo y riñón.
Para vericar la calidad e integridad del ADN se recurrió a la técnica
de la reacción en cadena de polimerasa conocida como PCR por sus
siglas en inglés (Polymerase Chain Reaction), utilizando los oligos
18SrRNA–F 5'–GTTAATTCCAGCTCCAATAGCGTA–3’ y 18SrRNA–R 5'–
GAACTACGACGGTATCTGATCGTC–3’ que amplican la subunidad
18S–ribosomal con un producto nal de 457 pb. Las condiciones de
amplicación fueron: 1 ciclo a 94°C, 5 min; 35 ciclos a 94°C 1 min;
57°C, 1 min y 72°C, 1 min. El análisis de los fragmentos de ADN se
realizó en un gel de agarosa al 2 % en buffer tris–acetato (TAE) en
una cámara de electroforesis (ENDURO LABNET, ENDURO 10,10, USA)
con voltaje de 88 por 30 min. Su pureza y cantidad se comprobaron
midiendo la absorbancia a 260 y 280 nm con un espectrofotómetro
DS–11 Fx (DeNovix, DS–11, USA).
Secuenciación de los aislados bacterianos
Las secuencias de las cepas RcM1 y RcM2 se obtuvieron con la
plataforma ILumina Miniseq(ILUMINA, Miniseq, USA) en una celda
de ujo de salida media (300 ciclos, 2 × 150 bp). Las bibliotecas de
ADN genómico se prepararon utilizando el kit de preparación de
bibliotecas Nextera®XT, mediante una única reacción enzimática
de "Tagmentacion", se cuantificaron con el kit de ensayo de
cuantificación de dsDNA (Invitrogen by life technologies, Qubit
2,0, USA) de alta sensibilidad para el uorómetro Qubit (Qubit 2
uorometer, USA) y se preparó un conjunto equimolar. Este conjunto
se cuanticó con el ensayo HS para el Qubit y se ajustó a 4 nM para
una mayor desnaturalización, dilución a 1 pM.
Análisis histopatológico
Las muestras de hígado, intestino, bazo y riñón fueron jadas por
inyección e inmersión en solución Davidson [14] por 36 h. Después
del proceso de fijación se sumergieron en etanol al 70 % para su
preservación. Las muestras se deshidrataron e impregnaron en parana
de acuerdo con la metodología de rutina de Bell y Lightner [15]. Una vez
incluida la parana en los tejidos se elaboraron los bloques de parana
empleando el embebedor (Leica ® modelo histoembedder) para cortar
las muestras a 4 μm utilizando un micrótomo manual (Thermo Scientic,
Hm325, China). Las muestras fueron teñidas con hematoxilina & eosina–
oxina (H&E) y examinadas para detectar alteraciones en órganos y
tejidos utilizando el microscopio óptico (Olympus, BX60, USA) con
cámara digital (Innity 2) para documentación.
Conrmación de virulencia bacteriana y postulados de Koch
Para cumplir los postulados de Koch, las bacterias aisladas (RcM1
y RcM2) de los organismos enfermos fueron inyectadas en forma
individual y combinada, intramuscularmente en ranas toro sanas, con
200 μL de cada bacteria para tener 400 μL 1×10
7
unidades formadoras
de colonias (UFC·mL
-1
). Se utilizaron un total de 5 ranas sanas para
el desafío de bacteria individual y 10 ranas sanas para la mezcla de
bacterias con un peso de 412 ± 0,3 g. Después del desafío, las ranas
fueron monitoreadas cinco veces al día para detectar la presencia
de signos clínicos y/o mortalidad durante un período de 5 días.
Se realizaron disecciones a las ranas clínicamente enfermas y se
tomaron muestras de hígado, riñón, bazo e intestino para análisis
de bacteriología, histopatología y molecular. Durante el estudio la
calidad del agua se mantuvo dentro de los parámetros establecidos
para la rana toro (Rana catesbeiana) en producción intensiva [12],
temperatura 26 ± 2°C, Oxígeno Disuelto 6,0 ± 1 ppm, Alcalinidad
Total 100 (mg·L
-1
CaCO
3
), Dureza Total 100 mg·L
-1
CaCO
3
, Nitratos
0mg·L
-1
, Nitritos 0 mg·L
-1
y Amoniaco <0,10 mg·L
-1
. Los parámetros
sicoquímicos evaluados se tomaron con multi sonda (556 MPS,
YSI, EUA), la dureza (mg·L
-1
CaCO
3
) y alcalinidad (mg·L
-1
CaCO
3
) fueron
tomadas con el kit de pruebas (FF–1A, HACH, Alemania), utilizando la
metodología del fabricante.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Bacteriología
La recuperación de las dos bacterias fue obtenida de hígado de
ranas clínicamente enfermas del bioensayo de mezcla (conrmación
de virulencia y postulados de Koch), se caracterizaron por ser en la
muestra RcM1 bacilos Gram negativos de colonia plana con núcleo
denido, color blanco opaco, borde circular denido transparente
que bioquímicamente fue identicada como Citrobacter freundii
con 100 % de probabilidad y para la muestra RcM2 Cocobacilos Gram
negativos de colonia plana, color beige sin núcleo, borde circular
denido transparente identicada como Edwardsiella tarda con
100 % de probabilidad (TABLA I).
Secuenciación de los aislados bacterianos
Se obtuvieron sucientes secuencias limpias para ensamblar
genomas de buena calidad (TABLA II). La identicación de las cepas
fue superior al 99 % de promedio de identidad en nucleótidos (ANI,
por sus siglas en inglés) con cepas referencia de las especies.
Análisis histopatológico
Las muestras tomadas de los organismos clínicamente enfermos
de la sala de reproductores del ranario del CIAD y de la infección
experimental, presentaron por histopatología alteración en órganos
TABLA I
Caracterización bioquímica mediante el Sistema API 20 E de la
bacteria Citrobacter freundii (RcM1) y Edwarsiella tarda (RcM2)
aisladas de reproductoras de rana toro (Rana catesbeiana)
Pruebas Abreviatura
RcM1
C. freundii
RcM2
E. tarda
Oxidasa OX – –
Catalasa CAT + +
Betagalactosidasa OPNG + –
Arginina dihidrolasa ADH + –
Descarboxilación de lisina LDC – +
Descarboxilación de ornitina ODC – +
Citrato CIT + –
Producción de hidrógeno:
Sulfurado H
2
S + –
Ureasa URE + –
Desanimación del triptófano TDA + –
Producción de indol IND + –
Voges Proskauer VP – –
Gelatinasa GEL + –
Producción de ácido:
Glucosa GLU + +
Manitol MAN – –
Inositol INO + –
Sorbitol SOR + –
Rhamnosa RHA – –
Sacarosa SAC + –
Melobiosa MEL + –
Amigdalina AMY + –
Arabinosa ARA + –
TABLA II
Características de los genomas obtenidos
Características
RcM1
C. freundii
RcM2
E. tarda
Número de secuencias limpias 3.359.164 4.526.498
Contigs 79 154
N
50
(Mpb) 215.766 45.007
Tamaño genoma (Mpb) 5,36 3,59
Cobertura (X) 57,4 113,7
Completeness (%) 100 100
Contamination (%) 0,25 0,35
GC (%) 51,44 57,45
ANI (%) 99,34 99,22
Núm. Genes (CDS) 5.410 3.488
Núm. RNAs 89 104
Num. Acceso NCBI
FIGURA 2. Cortes histológicos de órganos y tejidos de Rana toro (Rana catesbeiana) donde se observa; A: Hígado con severa
inltración de eritrocitos, trombocitos, formación de nódulos (echa azul) con aglomerados bacterianos en el centro,
inltración de broblastos rodeando al nódulo, macrófagos pigmentados multifocal de color marrón obscuro (echa
verde) y necrosis multifocal (echa amarilla). B: Bazo, presencia formación de nódulos (echa amarilla), aglomerados
bacterianos en el centro (echa azul), inltración de broblastos rodeando al nódulo. C: Bazo con macrófagos pigmentados
multifocal de color amarillo verdoso obscuro (echa verde) y necrosis multifocal. D: En Riñón, se aprecia necrosis multifocal
e inltración células sanguíneas (echa café). E: Intestino con necrosis multifocal y perdida de la estructura original (echa
blanca), mucosa y epitelio con desprendimiento celular y necrosada (echa negra) y macrófagos pigmentados multifocal
de color amarillo dorado (echa verde). Tinción Hematoxilina–Eosina
A B C
D E
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y tejidos: Hígado, macrófagos pigmentados multifocal de color
marrón obscuro y necrosis multifocal. Bazo, formación de nódulos
y aglomerados bacterianos en el centro, inltración de broblastos
rodeando al nódulo, macrófagos pigmentados multifocal de color
amarillo verdoso y necrosis multifocal. Riñón, necrosis multifocal e
inltración células sanguíneas. Intestino, necrosis multifocal y pérdida
de la estructura original, mucosa y epitelio con desprendimiento
celular y necrosada con macrófagos pigmentados multifocal de color
amarillo dorado (FIG. 2).
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Conrmación de virulencia bacteriana y postulados de Koch
Las ranas inyectadas de manera individual con las bacterias RcM1 y
RcM2 mostraron a las 45 h post infección letargo, anorexia y piel pálida,
para ambas bacterias; a las 100 h se inició la expansión abdominal
(hidropesía) con la bacteria RcM1 y a las 110 h con la bacteria RcM2; las
lesiones macroscópicas en patas traseras se presentaron a las 112 h
solo para RcM2; y por último, la mortalidad para ambas inicio a las 115 h.
En los organismos con mezcla de bacterias las características
externas y lesiones observadas en las reproductoras con mortalidad
atípica en la sala de reproducción CIAD, se observaron en los
organismos clínicamente enfermos a las 70 h y la mortalidad inicio
a las 72 h, seleccionando los organismos clínicamente enfermos para
los análisis de bacteriología, molecular e histopatología.
No hay estudios previos que describan la coinfección por C. freundii
y E. tarda en rana toro, es la primera descripción de una coinfección de
estas dos bacterias causantes de lesiones microscópicas en órganos
y tejidos como hígado, bazo, riñón intestino y muerte en rana toro.
Se ha reportado que en animales estresados por connamiento
y alteración de parámetros ambientales, es más probable que se
detecten bacterias potencialmente patógenas que en organismos
sanos y en libertad [16]. Los efectos del cautiverio y temperatura alta
pueden ser factores potenciales para desencadenar la coinfección
bacteriana oportunista observada en la rana toro. Las alteraciones
observadas por histopatología en intestino probablemente se deban
a C. freundii, ya que ha sido reportada en peces y aves que penetra la
mucosa intestinal, desencadenando bacteriemia [17].
Las patologías reportadas en este trabajo, en hígado, riñón, bazo y
lesiones en piel probablemente se deban a E. tarda ya esta bacteria
puede adherirse y penetrar en las células epiteliales [18, 19, 20, 21]. La
capacidad de E. tarda para invadir células HeLa (una línea de células
epiteliales obtenida a partir de un carcinoma humano) y producir β–
hemolisina sugiere que las patologías invasivas observadas en especies
de peces cultivadas pueden estar relacionadas con esta propiedad
[20] y probablemente pueda estar relacionada con las patologías
encontradas en las reproductoras rana toro de esta investigación.
En la mayoría de las bacterias patógenas invasivas se ha comprobado
que el aumento de la concentración de hierro en el hospedador implica
una mayor susceptibilidad a la infección [22]. Esto hace que la capacidad
de captación de este elemento constituya uno de los principales factores
de virulencia de los microorganismos patógenos. Hasta la actualidad, se
conoce poco sobre los mecanismos de captación de hierro de E. tarda.
Kokubo y cols. [22] y Dhaenens y cols. [23] publicaron que E. tarda posee
un sistema de captación de hierro mediado por sideróforos el cual es
necesario para su supervivencia dentro del hospedador.
En peces inoculados con E. tarda, se han reportado lesiones de
septicemia, como: hiperemia con congestión sanguínea de aletas, con
hemorragias petequiales en diferentes partes del cuerpo. Internamente
con hiperemia general del peritoneo, hígado moteado y con edemas
[24], lo cual está acorde con lo observado en el presente trabajo. En
el bazo de los organismos, la presencia de nódulos blanquecinos de
distribución multifocal fue similar a lo descrito por Rondón et al. [25]
quienes demostraron el desarrollo de lesiones similares en infecciones
naturales por E. tarda. De la misma manera, Muroga [26] ha reportado
la presencia de puntos blancos similares a granulomas, que contienen
grupos de bacterias con fagocitos alterados y cubiertos por tejido
broso que se desarrollan en el bazo y riñón en Yellowtail infectados
experimentalmente con Pasteurella piscida.
CONCLUSIONES
Este es el primer reporte de Citrobacter freundii y Edwardsiella tarda
en reproductoras de rana toro (Rana catesbeiana). La enfermedad
se caracterizó por daños en órganos y tejidos vitales causando alta
mortalidad en pocos días. Los aislados son bacterias oportunistas
que causan mortalidades cuando los organismos se encuentran
estresados lo que representa importancia clínica no sólo para el
cultivo de ranas, sino también por el riesgo de circulación entre
diferentes huéspedes.
Conicto de Intereses
Los autores declaran la no existencia de conflictos en el
presente trabajo.
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