DOI: https://doi.org/10.52973/rcfcv-e32112
Recibido: 13/01/2022 Aceptado: 27/02/2022 Publicado: 31/05/2022
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Revista Cientíca, FCV-LUZ / Vol. XXXII, rcfcv-e32112, 1 - 10
RESUMEN
Esta investigación tuvo por objetivo la caracterización bioquímica y la
identicación de logrupos en cepas de Escherichia coli, de heces de
terneros con diarrea, mediante el método de Clermont. Se recogieron
treinta y dos muestras de ocho rebaños del caserío Tartar Grande,
distrito Baños del Inca, región Cajamarca, Perú. Mediante el crecimiento
en agar MacConkey-MUG fueron seleccionadas trece muestras
caracterizándose bioquímicamente mediante kit EnteroPluri®-Test
e identicadas molecularmente mediante amplicación del gen uidA
mediante la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR); se
tipicó el logrupo por PCR cuádruplex de Clermont. Las cepas locales
aisladas mostraron un perl bioquímico fermentadoras de sorbitol
y glucosa permitiendo agruparlas e identicarlas en cinco grupos
(códigos 71340; 71350; 51340; 61740 y 61340); además se amplicó el
gen uidA que codica la enzima beta-glucuronidasa propias del linaje
de E. coli. La identicación del grupo logenético permitió observar
que están agrupadas en el grupo B1 (69,23%), F (15,38%), además los
grupos A (7,69%) y D o E (7,69%) se distribuyen proporcionalmente
en todas las muestras analizadas, se logró mediante amplicación de
los genes arpA, chuA, yjaA, TspE4.C2. Las cepas locales aisladas de
heces de terneros con diarrea representan poblaciones bacterianas
naturalizadas y adaptadas al nicho ecológico de Cajamarca, teniendo la
ganadería regional como principal fuente de alimentación las pasturas,
posiblemente la contaminación de estas se traduce en un importante
medio de transmisión en terneros para la presentación de colibacilosis,
ya que estas cepas albergan la mayor proporción de genes de virulencia.
Palabras clave: Escherichia coli; Clermont; caracterización; logrupos
ABSTRACT
The objective of this research was the biochemical characterization
and the identication of phylogroups in Escherichia coli strains, from
feces of calves with diarrhea, using the Clermont method. Thirty-two
samples were collected from eight herds from the Tartar Grande
Hamlet, Baños del Inca District, Cajamarca Region, Peru. Through
growth on MacConkey-MUG agar, thirteen samples were selected,
characterized biochemically using the EnteroPluri®-Test kit and
molecularly, the strains were identied by amplication of the uidA
gene using the polymerase chain reaction (PCR) technique; the
phylogroup was typied by Clermont quadruplex PCR. The isolated local
strains showed a sorbitol and glucose fermenting biochemical prole,
allowing them to be grouped and identied into ve groups (codes
71340; 71350; 51340; 61740 and 61340); In addition, the uidA gene that
encodes the beta-glucuronidase enzyme typical of the E. coli lineage
was amplied. The identication of the phylogenetic group allowed
to observe that they are grouped in group B1 (69.23%), F (15.38%), in
addition to groups A (7.69%) and D or E (7.69%) respectively. It was
achieved by amplication of the arpA, chuA, yjaA, TspE4.C2 genes.
The local strains isolated from feces of calves with diarrhea represent
naturalized bacterial populations adapted to the ecological niche of
Cajamarca, having regional livestock as the main source of food for
pastures, possibly contamination of these translates into an important
means of transmission in calves for the presentation of colibacillosis,
since these strains harbor the highest proportion of virulence genes.
Key words: Escherichia coli; Clermont; biochemical characterization;
phylogroups
Caracterización bioquímica y logrupos de Escherichia coli aislados de
heces de terneros con diarrea en la Región Cajamarca, Perú
Biochemical characterization and Phylogroups of Escherichia coli isolated from feces of
calves with diarrhea in the Cajamarca Region, Peru
Marco Cabrera-González
1
* , Sámy Káterin Chávez-Díaz
1
, Rodolfo Gustavo Gamarra-Ramírez
2
, Héctor Vladimir Vásquez
3
,
Carlos Quilcate-Pairazamán
3
y Medali Cueva-Rodríguez
1
1
Instituto Nacional de Innovación Agraria (INIA), Dirección de Desarrollo Tecnológico Agrario, Estación Experimental Baños del Inca. Baños del Inca, Cajamarca,
Perú.
2
Universidad Nacional de Cajamarca, Facultad de Ciencias Veterinarias, Laboratorio de Microbiología Veterinaria. Cajamarca, Cajamarca, Perú,
3
Instituto
Nacional de Innovación Agraria (INIA), Dirección de Desarrollo Tecnológico Agrario. La Molina, Lima, Perú.
*Correo electrónico: mcabrera9@gmail.com
Caracterización bioquímica y logrupos de Escherichia coli aislados en Perú / Cabrera-González y col. ___________________________________
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INTRODUCCIÓN
Escherichia coli es una especie bacteriana versátil por su alta
morbilidad, así como la variedad en síndromes y cuadros clínicos
asociados a las infecciones por este patógeno; se encuentra presente
en el tracto digestivo de muchos vertebrados, incluido el hombre [11],
en la mayoría de los animales se considera como habitante normal de
los intestinos [41], incluyendo los humanos, como sucede con las cepas
patógenas que causan diversas infecciones intra y extra intestinales.
A pesar del extenso ujo de genes entre las cepas, la especie E. coli
tiene una estructura de población globalmente clonal, que consiste
en distintos grupos logenéticos [2, 11]. En Cajamarca, Perú, de 314
muestras de agua potable, se identicaron coliformes termotolerantes
(CT) en 55,4% y entre las muestras positivas para CT, E. coli se aisló en
37,3%; Klebsiella spp. en 8,0%; Enterobacter spp. en 5,1% y Citrobacter
spp. en 2,5%. De estos aislados de E. coli, un 48,7% mostró resistencia
a los antibióticos [29]; reconociéndose la resistencia que presentan las
bacterias frente a los diversos antibióticos como un grave problema
para la salud pública a escala global [37].
La diarrea de terneros (Bos taurus) asociada con patógenos
infecciosos es un problema importante para los productores de
lácteos de todo el mundo [17, 18, 28]. Así la mortalidad y los costos
de tratamiento son causas importantes de pérdidas económicas
para la industria láctea [14]. Las E. coli genéricas son una población
abundante de bacterias entéricas comensales en animales y humanos y
son ubicuas en el medio ambiente [13, 48]. Debido a la gran importancia
que se da a esta bacteria en la medicina, se determina y clasica la E.
coli en cepas patógenas y no patógenas, encontrándose a disposición
diferentes métodos, entre los que cabe indicar: perl bioquímico,
pato tipificación, serotipificación, análisis filogenético [20]. Así
mismo, es posible identicarlas mediante electroforesis de enzimas
multilocus, tipicación multilocus de secuencias, reacción en cadena
de la polimerasa (PCR) mediante la utilización de un termociclador
PCRmax, AC 196, Reino Unido y sus respectivas variantes [10, 20, 36].
También la E. coli patógena causa millones de casos de disentería,
mientras que E. coli no patógena se considera como parte normal de
la ora intestinal en los mamíferos y en las aves [49].
Según el análisis logenético se reporta que, E. coli está compuesta
por cuatro grupos logenéticos, siendo los principales, A, B1, B2 y D y
que las cepas extra intestinales virulentas pertenecen principalmente
a los grupos B2 y D [12]. La determinación estructural de E. coli con
respecto a su fuente de aislamiento fueron los logrupos B2 o D cepas
causantes de infección intestinal [25, 39]. Posteriormente mediante
PCR se determinó la presencia de los genes chuA, yjaA y un fragmento
de ADN TspE4.C2, además se caracterizó un gen putativo de lipasa
esterasa [20]; por lo que basado en la presencia o ausencia de estos
3 genes se podría clasicar los logrupos en A, B1, B2 y D [12].
Estudios de tipicación multilocus de secuencias – MLST y del
genoma de E. coli posibilitaron la mejora en su comprensión y de la
subestructura, así se reconoce la existencia del logrupo E pequeño
conjunto que no habían sido asignadas y donde la cepa O157:H7 es el
más representativo [42]. En la actualidad se reconoce al logrupo
F las cuales son cepas hermanas del logrupo B2 [11, 42]. Estudios
recientes han permitido proponer al logrupo C el cual se relacionaba
al logrupo B1 del cual diere [11, 34].
Otros investigadores como Luo y col. [33] informaron sobre
linajes nuevos de cepas de E. coli genéticamente distintas, pero
fenotípicamente indistinguibles [47], por lo que al menos uno de
estos linajes de E. coli clado I basado en el grado de recombinación
entre este clado y E. coli [33]. Motivo por lo cual se reconocen ocho
grupos: siete como A, B1, B2, C, D, E, F que pertenecen a E. coli
sensu stricto, mientras que el octavo es Escherichia cryptic clade I.
El método de Clermont establece principalmente la vinculación entre
el grupo logenético y la virulencia mediante la determinación de los
genes chuA, yjaA, TspE4.C2 y arpA [6, 48]. Finalmente, el objetivo del
presente estudio fue la caracterización bioquímica e identicación
de grupos logenéticos de cepas locales de E. coli aisladas, de heces
de terneros con diarrea, mediante el método de Clermont.
MATERIALES Y MÉTODOS
Muestras y cepas bacterianas
Entre enero y marzo de 2019 se recolectó un total de 32 muestras
fecales diarreicas en terneros de hasta 1 mes post nacimiento, de raza
Holstein, en 08 fundos ganaderos ubicados en el caserío de Tartar
Grande: El Triunfo (7°9'10.08" S, 78°28'18.81" O); La Merced (7°8'13.22"
S, 78°28'52.45" O); La Victoria (7°11'32.06" S, 78°27'51.3" O); Rabanal
(7°7'33.61" S, 78°26'52.59" O); San Antonio (7°9'12.32" S, 78°28'27.89" O);
San Vicente de Paul (7°9'12.15" S, 78°28'24.62" O); Santa Teresa (7°9'21.87"
S, 78°28'6.43" O); Tartar UNC (7°9'46" S, 78°28'25.34" O); distrito de Baños
del Inca, Región de Cajamarca, Perú (FIG. 1).
El aislamiento se realizó en los laboratorios de Biotecnología en
Sanidad Animal de la Estación Experimental Agraria Baños del Inca
y Microbiología Veterinaria de la Universidad Nacional de Cajamarca,
Cajamarca
Las muestras fueron tomadas directamente del recto mediante
bolsas de propileno de primer uso. Aproximadamente 1 gramo (g) de
heces fue diluido en 10 mililitros (mL) de agua peptonada tamponada
al 1%, incubando luego a 37° C durante 24 horas (h) en estufa (Estufa
universal Memmert UN-110/ Schwabach/Alemania).
Caracterización bioquímica
Los ensayos fueron realizados empleando el kit EnteroPluri
®
-Test
fermentación (glucosa, adonitol, lactosa, arabinosa, sorbitol, dulcitol);
producción (gas, ácido sulfhídrico (H
2
S), indol, producción de acetoína
/
Voges-Proskauer
); descarboxilación (lisina, ornitina); desaminación
(fenilalanina); hidrólisis de urea; utilización de citrato para identicar
entero bacterias y otras bacterias Gram (-).
Posteriormente, una alícuota con 4 microlitros (µL) de la muestra
sembrada en caldo peptonado fue sembrada por estrías en placa
con Agar MacConkey MUG (Liolchem–REF.610170), incubándose
(Memmert/ICO-50/Schwabach/Alemania) en condiciones aeróbicas
a 35°C durante 24 h, identicando las colonias rosadas que uorescen
azul-verde bajo luz ultra violeta (UV) en el rango de 366 nanómetros
(nm). Una o dos colonias de cada muestra fueron seleccionadas con
características Gram (–) y oxidasa (-) para ser utilizadas en los ensayos
bioquímicos para su identicación como colonias de E. coli mediante el
kit EnteroPluri
®
-Test–Liolchem (certicado de calidad N° 78618–78619).
Posteriormente según instrucciones del protocolo del fabricante se
realizó la interpretación de reacción (TABLA I)
Posteriormente se asignaron código según reacción bioquímica,
los que se dividen en 5 grupos que contienen 3 test y cada test se
indica con un valor de positividad de 4; 2; 1, según corresponda: Valor
4: cebadores test positivo de cada grupo (Glucosa, Ornitina, Adonitol,
Sorbitol, Fenilalanina); Valor 2: segundo test positivo de cada grupo (Gas
H
2
S, Lactosa, Voges-Proskauer, Urea); Valor 1: tercer test positivo de
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TABLA I
®
Sectores
Glucosa /
Gas
Fermentación de la glucosa y producción de gas en anaerobiosis Amarillo Rojo
Producción de gases Cera suelta Cera adherida
Lisina Descarboxilación de la lisina en anaerobiosis Violeta Amarillo
Ornitina Descarboxilación de la ornitina en anaerobiosis Violeta Amarillo
H
2
S /
Indol
Producción de hidrógeno saturado Negro-marrón Beige
Producción de indol Rosa-rojo Incoloro
Adonitol Fermentación del adonitol Amarillo Rojo
Lactosa Fermentación de la lactosa Amarillo Rojo
Arabinosa Fermentación de la arabinosa Amarillo Rojo
Sorbitol Fermentación del sorbitol Amarillo Rojo
Voges-Proskauer Producción de acetoina Rojo Incoloro
Dulcitol /
Fenilalanina
Fermentación del dulcitol Amarillo Verde
Deaminación de la fenilalanina Marrón Oscuro Verde
Urea Hidrólisis de la urea Púrpura Beige
Citrato Utilización del citrate Azul Verde
cada grupo (Lisina, Indol, Arabinosa, Dulcitol, Citrato); Valor 0: cada test
negativo. Sumando a cada grupo los números de la reacción positiva
se obtuvo un código de 5 cifras que utiliza el manual de códigos del
test EnteroPluri-Test lo que permitió identicar al microorganismo.
Extracción del ácido desoxirribonucleico (ADN)
Dos o tres colonias de E. coli seleccionadas se cultivaron en medio
líquido 2xYT (Sigma, REF. Y2377) a 37°C. por 18 h y se evaluó utilizando
un espectrofotómetro PCR MAX Lambda 64272, Bibby Scientic Ltd,
Reino Unido, mediante concentración y densidad óptica predispuesta
en el espectrofotómetro se determinaron las Unidades Formadoras de
Colonia (UFC) a 600 nm, para contabilizar el crecimiento de bacterias
viables en el medio líquido. La extracción de la plantilla de ADN de E.
coli fue realizada mediante kit de puricación Wizard
®
Genomic DNA
(Promega, REF. A1120), según instrucciones del fabricante, el ADN
obtenido fue almacenado en refrigeración utilizando una refrigeradora
Samsung, RT35K5930S8/PE, Samsung, México de 4°C, el cual fue
utilizado como plantilla para los diversos ensayos de PCR.
Caracterización bioquímica y logrupos de Escherichia coli aislados en Perú / Cabrera-González y col. ___________________________________
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Análisis para identicación y determinación /logrupo
La identicación molecular de E. coli procedentes de terneros
con diarrea se determinó mediante PCR empleando “cebadores”
(F5'-TCAGCGCGAAGTCTTTATACC-3'; R5'-CGTCGGTAATCACCATTCCC-3'),
para amplicación del gen uidA (248pb), [25, 27]. El perl térmico de la
reacción de PCR fue: desnaturalización inicial 94°C—2 minutos (m), 25
ciclos (desnaturalización 94°C—30 segundos (s); hibridación 55°C—30s;
extensión 72°C—45 s) y extensión nal 72°C—2 m.
Los fragmentos de ADN amplicado para identicar la cepa de E.
coli y logrupo se separaron por su tamaño mediante electroforesis
—agarosa 1%. El análisis de los fragmentos se realizó a través de tinción
del gel con Sybr Green (Thermo Fisher) y su observación fue realizada
en transiluminador UV 302 nm Labnet U1001 Taiwan [50].
Para determinar filogrupo A, B1, B2, C, D, E o F en E.coli de las
muestras diarreicas, se usó un PCR–cuádruplex, basado en la
amplicación de genes chuA, yjaA, TspE4.C2 y arpA [9] (TABLA II).
La amplicación se realizó en un volumen de 20 µL, conteniendo
4 µL de tampón 5X (suministrado con Taq polimerasa), dNTPs 0,6 µL
(2,5 microMol [µM]), Taq Polimerasa 0,2 unidades (U), 2,8 µL de ADN
aproximadamente 100 nanogramos (ng)·mL
-1
). Los cebadores que se
utilizaron fueron chuA-FR (1µL·10 µM
-1
), yjaA-FR (1µL·10 µM
-1
), TspE4.
C2-FR (1µL·10 µM
-1
) y arpA (1µL·10 µM
-1
).
El perl térmico de la reacción de amplicación empleado fue:
desnaturalización inicial 94°C—4 m, 30 ciclos (desnaturalización
94°C —5 s, hibridación 57°C—20 s, extensión 59°C—20 s) y extensión
nal 72°C—5 m.
Análisis estadístico
Se realizó mediante el software SPSS para Windows (V. 24.0; IBM.
Corp., Armonk, Nueva York, Estados Unidos). Se utilizó el método
de clasificación jerárquica para las variables evaluadas (pruebas
bioquímicas: glucosa, gas, lisina, ornitina, H
2
S, indol, adonitol, lactosa,
arabinosa, sorbitol, Voges-Proskauer, dulcitol, fenilalanina, urea, citrato),
la agrupación de clústeres se realizó mediante Criterio de varianza
mínima de Ward.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Aislamiento de cepas
Del total de muestras recogidas de campo y sembradas en agar
MacConkey MUG se seleccionaron 13 muestras, como cultivos
positivos de E. coli.
Caracterización bioquímica
Se pudo determinar que las cepas aisladas de E. coli provenientes de
muestras de terneros con diarrea (TABLA III) las que fueron agrupadas
de acuerdo a positividad (+) o negatividad (-) de la reacción bioquímica
en cinco grupos con código : 71340 + (glucosa, gas, lisina, indol, lactosa,
arabinosa, sorbitol); – (ornitina , H
2
S, adonitol, Voges-Proskauer, dulcitol,
fenilalanina, urea, citrato). 71350 + (glucosa, gas, lisina, indol, lactosa,
arabinosa, sorbitol, dulcitol); – (ornitina, H
2
S, adonitol, Voges-Proskauer,
fenilalanina, urea, citrato). 51340 + (glucosa, lisina, indol, lactosa,
arabinosa, sorbitol); – (gas, ornitina, H
2
S, adonitol,
Voges-Proskauer
,
dulcitol, fenilalanina, urea, citrato). 61740 + (glucosa, gas, indol, adonitol,
lactosa, arabinosa, sorbitol); – (lisina, ornitina, H
2
S, Voges-Proskauer,
dulcitol, fenilalanina, urea, citrato). 61340 + (glucosa, gas, indol, lactosa,
arabinosa, sorbitol); – (lisina, ornitina, H
2
S, adonitol,
Voges-Proskauer
,
dulcitol, fenilalanina, urea, citrato), presentando reacción negativa en
todas las cepas aisladas para la reacción bioquímica de fenilalanina,
urea y citrato.
Se realizó un dendograma de clasicacion según Ward para asignar
puntaje elaborado, 4; 2; 1, para los diferentes procesos bioquímicos
indicados en el kit EnteroPluri
®
-Test en la identicación de cepas de E.
coli, donde se pudo observar en el clúster 1 que las características que
presentan las cepas de E. coli, es mayor en actividad sobre la glucosa
y el sorbitol, luego por preponderancia continua el clúster 2, que son
fermentadoras de lactosa, y productoras de gas, y el tercer clúster de
baja relevancia se encuentran la mayoría de los componentes como
Lisyna, Ornitina, H
2
S, Indol, Arabinosa,
Voges-Proskauer
, Dulcitol, Urea,
Citrato (FIG. 2).
Identicación molecular y logrupo de E. coli
Para la identicación de cepas locales de E. coli presentes en heces
de terneros con diarrea, se amplicó el gen uidA el cual codica la
enzima β–glucoronidasa. El análisis de los productos de amplicación
TABLA II
Escherichia coli
Gen
chuA.1b
chuA
F5'-ATGGTACCGGACGAACCAAC-3'
288 Clermont y col. (2013)
chuA.2 R5'-TGCCGCCAGTACCAAAGACA-3'
yjaA.1b
yjaA
F5'-CAAACGTGAAGTGTCAGGAG-3'
211 Clermont y col. (2004)
yjaA.2b R5'-AATGCGTTCCTCAACCTGTG-3'
TspE4C2.1b
TspE4.C2
F5'-CACTATTCGTAAGGTCATCC-3'
152 Clermont y col. (2004)
TspE4C2.2b R5'-AGTTTATCGCTGCGGGTCGC-3'
ArpAgpE.f
arpA
F5'-GATTCCATCTTGTCAAAATATGCC-3'
301 Lescat y col. (2012)
ArpAgpE.r R5'-GAAAAGAAAAAGAATTCCCAAGAG-3'
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TABLA III
Escherichia coli
®
Código positivo 4 2 1 4 2 1 4 2 1 4 2 1 4 2 1
Resultados
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-
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-
Código 7 1 3 5 0
/ Escherichia coli
Código positivo 4 2 1 4 2 1 4 2 1 4 2 1 4 2 1
Resultados
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Código 7 1 3 5 0
/ Escherichia coli
Código positivo 4 2 1 4 2 1 4 2 1 4 2 1 4 2 1
Resultados
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Código 5 1 3 4 0
/ Escherichia coli
Código positivo 4 2 1 4 2 1 4 2 1 4 2 1 4 2 1
Resultados
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Código 6 1 7 4 0
/ Escherichia coli
Código positivo 4 2 1 4 2 1 4 2 1 4 2 1 4 2 1
Resultados
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Código 6 1 3 4 0
/ Escherichia coli
Caracterización bioquímica y logrupos de Escherichia coli aislados en Perú / Cabrera-González y col. ___________________________________
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fue realizado mediante electroforesis en gel de agarosa al 1%, método
simple y ecaz para separar, así también, identicar y puricar
fragmentos de ADN entre un peso molecular de 0,5 a 25 kb [46].
Se observaron bandas electroforéticas del tamaño esperado: 248
cepas son portadoras los genes de virulencia en el ganado vacuno
productora de leche [45].
El método de PCR cuádruplex de Clermont se ha observado que
es útil en la identicación logenética de E. coli por ser económico,
fácil de utilizar y con buen rango de ecacia se basa en la evaluación
del gen yjaA que codica una proteína hipotética, en el genoma de E.
coli K-12; gen chuA está ubicado en la membrana externa importante
en el transporte de hemo de la cepa O157:H7; una secuencia de ADN
TspE4.C2 ubicada dentro de un gen que codica lipasa esterasa [15]
y el gen arpA que codica la proteína de repetición de arquinina [9].
La presencia de genes amplicados en gel de agarosa al 1% para
la determinación de los logrupos se puede observar B1, F, A, D o E.
(TABLA IV)
pares de base (pb) positivas para la región amplicada del gen uidA.
El mismo fue detectado en el 92,30% de las muestras analizadas,
lo cual evidencia la identicación de E. coli, dado que este gen es
especíco para esta bacteria (FIG. 3).
uidA
La relación de logrupo en E. coli aisladas se determinó mediante
Clermont y col. [9], basándose en productos amplicados por PCR
cuádruplex correspondiente a los genes chuA (288 pb), yjaA (211 pb),
fragmento de ADN TspE4.C2 (152 pb), arpA (301 pb), la amplicación de
los genes se relacionó con la identicación de logrupos encontrados
en las muestras analizadas A, B1, D o E y F. (TABLA II).
Se pudo observar que el porcentaje de logrupos encontrados en
las 13 muestras aisladas de terneros con diarrea están ubicadas en
el grupo B1 (69,23%), F (15,38%), mientras que los grupos A (7,69%)
y D o E (7,69%), respectivamente. Lo que sugiere que las cepas B1
mantienen poblaciones ligeramente mayores que sus contrapartes
y está asociado principalmente a terneros con problemas de diarrea
por motivo que este logrupo es más virulento debido a que estas
TABLA
Gen arpA Gen chuA Gen yjaA
a1 + - - + B1
a2 + - - + B1
a3 + - - + B1
a4 + - - + B1
a5 + - - + B1
a6 + - - + B1
a7 + - - + B1
a8 + + - - D o E
a9 + - - + B1
a10 + - - + B1
a11 + - - - A
a12 - + - - F
a13 - + - - F
B1 (+ – – +), F ( – + – -), A (+ – – -), D o E (+ + – -)
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E. coli se encuentra en la ora intestinal en animales y humanos [26],
pudiendo producir enfermedad, la cual cursa con diarrea frecuentemente
en terneros jóvenes principalmente durante los primeros días de vida [1],
ocasionando importantes pérdidas económicas para los productores en
todo el mundo [8, 17, 48]. Con la nalidad de conocer las características
bioquímicas, logrupo de E. coli en muestras diarreicas de terneros
en la Región Cajamarca, Perú, se identicaron 13 muestras mediante
EnteroPluri®-Test, para la identicación de enterobacterias; habiéndose
comprobado que los aislados correspondían a E. coli; pudiéndose
observar que el 100% de cepas cultivadas mostraron sorbitol lo cual
concuerda con otros resultados reportados por Picard y col. [39, 44],
como lo que se menciona, que en estudio realizado en Chile donde 56
muestras de carne de bovino contaminadas con esta bacteria fueron
fermentadoras de sorbitol hasta un 98,2%.
Otros estudios realizados por Orth y col. [38] reportan una infección
por E. coli de una familia de granjeros de Salzburgo – Austria, de la
cual las muestras procedían de 42 animales de la granja siendo todas
fermentadoras de sorbitol (identicado por API 20E; bioMérieux,
Marcy-l’Etoile, Francia) post incubación en agar MacConkey sorbitol.
Teniendo en cuenta que las muestras obtenidas procedían de terneros
con diarrea, al observar la positividad de estas cepas a la prueba
bioquímica del D-Sorbitol, el cual es un carbohidrato fermentable,
donde la mayoría de las cepas hemorrágicas de E. coli no fermentan se
puede mencionar que, esto fue reportado por primera vez en Alemania,
constituyéndose como un patógeno emergente, capaz de producir
enfermedad potencialmente mortal, presentándose en un 10 a 20% de
los casos esporádicos y además provocando brotes más importantes y
de mayor magnitud [4]. Por lo que se sugiere que el ganado vacuno puede
albergar cepas locales de E. coli fermentadoras del sorbitol, teniendo
en cuenta que E. coli 057:H7 no fermentadora de sorbitol está presente
en este reservorio animal [5], la cual es productora de la toxina shiga
E. coli 0157:H7, presente en infecciones entéricas graves, incluyendo
colitis hemorrágica y síndrome urémico hemolítico [35].
La importancia de la identicación y amplicación del gen uidA
mediante PCR, se da debido a que es un gen especíco del linaje de
E. coli [21] y es utilizado a menudo en muchas investigaciones por
ser especifico [22]. Bajo este mismo contexto , la amplificación
realizada a la región del gen uidA utilizando ADN extraído de los cultivos
identicados mediante pruebas bioquímicas, generaron amplicones
especícos del tamaño esperado (FIG. 4); coincidiendo con otros
estudios publicados que confirman, que mediante amplificación
dirigida al gen uidA se puede detectar en forma directa E. coli [22]. Otras
investigaciones realizadas por Asim y col. [3] muestran amplicaciones
del gen uidA similares a las encontradas en los resultados mediante
PCR basándose en regiones especícas del gen, no observándose
amplificación para otras bacterias entéricas y no entéricas [3].
Otros investigadores como Liy y col. [32] mencionan que, el género
Escherichia comprende muchas especies, entre los cuales se tienen
E. coli, E. hermanii, E. vulneris, E. fergusonii, E. albertii y E. marmotae
siendo, todas las cepas utilizadas provenientes del tracto intestinal
bovino, de muestras aisladas de terneros relacionados son síntomas
de enfermedad diarreica, están dentro de la especie E. coli.
En cuanto a la clasicación de logrupo de E. coli a partir de las
muestras diarreicas de terneros, se han basado en la utilización del
protocolo de trabajo de agrupación publicado por Clermont y col. [9], lo
cual permitió observar que estas cepas locales de E. coli se encontraban
en el logrupo B1 en mayor proporción y en el logrupo A en menor
proporción, siendo ambos grupos asociados a procesos ambientales,
representando a poblaciones bacterianas naturalizadas y adaptadas
al nicho ecológico y asociado principalmente a contaminación de las
pasturas, lo que se traduce en un importante medio de transmisión en
terneros para la presentación de colibacilosis, ya que estas poblaciones
bacterianas pueden ser naturalizadas, pudieron haber sobrevivido a las
condiciones ambientales de la región de Cajamarca y se adaptaron a las
pasturas que sirven como alimentación del ganado [7, 23, 43], ya que es
una especie versátil que abarca comensales inofensivos, así también
cepas patógenas con la capacidad de causar infección intestinales o
extraintestinal en muchos huéspedes como humanos y animales [31].
Los resultados obtenidos en cuanto al logrupo B1 encontrado se
asemejan a otras investigaciones realizadas, donde se menciona que
este grupo es el más numeroso hallado en pasturas para ganado en
donde se reporta aislamientos del grupo B1 (66%) en muestras de suelo,
(32%) en heces de bovinos y (40%) en pasturas [19] y hay que tener
en cuenta que los grupos B1 y A pueden constituirse como patógenos
intestinales y provocar enfermedad en los terneros [40].
Es así que, con los datos obtenidos se puede considerar que los
factores de virulencia se asocian al logrupo siendo importante esta
característica, debido que en la región Cajamarca el logrupo B1 se
presenta en mayor proporción, las cepas portadoras de este grupo tienen
mayores genes de virulencia en ganado vacuno lechero [45]. Por otro lado,
Tenaillon y col. [42] mencionan que, la evidencia en determinar que los
diferentes grupos logenéticos juegan distintos roles ecológicos; como
por ejemplo en humanos, se presentan principalmente los logrupos A
(40%) y B2 (25,5%) y en menor proporción son menos prevalentes los
E. coli
Caracterización bioquímica y logrupos de Escherichia coli aislados en Perú / Cabrera-González y col. ___________________________________
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logrupos B1 y D (17%); mientras que en animales los logrupos más
prevalentes son B1 (41%) siguiendo A (22%), B2 (21%) y D (16%), con lo
cual se demuestra que el logrupo encontrado en terneros en la región
de Cajamarca es también el logrupo B1. Además, se observaron cepas
pertenecientes al logrupo F, las cuales son cepas provenientes de
reservorios animales, considerándolas como comensales del intestino
de animales, pudiendo causar enfermedades diarreicas extraintestinales
severas [30]; es importante tener en cuenta en cuanto al logrupo F está
formado por un grupo hermano relacionado con el logrupo B2 [11, 24].
Por otra parte, en los resultados del presente estudio se observó la
existencia de cepas de los logrupos pertenecientes a D o E (+ + – -) según
la clasicación de Clermont y col. [9], otras investigaciones maniestan
que estos logrupos están relacionados, así también mencionan que
el logrupo F está relacionado con el grupo logrupo B2, grupo que se
presenta más en humanos [16, 39]. Esto posiblemente se deba al medio
ambiente, anatomía del intestino, condiciones medio ambientales del
nicho ecológico, que inuyen en la estructura logenética de E. coli,
aisladas de muestras de terneros con diarrea [42].
CONCLUSIONES
La identicación de cepas bacterianas locales, aisladas de muestras
fecales de terneros identicados mediante amplicación del gen
uidA especico del linaje de E. coli, las cuales son principalmente
fermentadoras de sorbitol y que presentan un perl logenético
mayoritariamente del grupo B1, permite concluir que se trata de
poblaciones bacterianas naturalizadas y adaptadas al nicho ecológico
de la región de Cajamarca, Perú, teniendo la ganadería regional
como principal fuente de alimentación las pasturas posiblemente
la contaminación de estas se traduce en un importante medio de
transmisión en terneros para la presentación de colibacilosis, ya que
estas cepas albergan la mayor proporción de genes de virulencia.
Además, se requiere realizar más estudios de caracterización de
estos aislamientos bacterianos incluidos su adaptación al medio
ambiente y grado de patogenicidad.
CONFLICTOS DE INTERESES
Los autores declaran que no existe ningún tipo de conicto de
intereses con la publicación de la presente investigación.
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