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MARACAIBO, ESTADO ZULIA, VENEZUELA
Vol. XXIX (4) 2019
UNIVERSIDAD DEL ZULIA
REVISTA CIENTÍFICA
FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS
DIVISIÓN DE INVESTIGACIÓN
265
Revista Cientíca, FVC-LUZ / Vol. XXIX, 4, 265 - 273, 2019
DETECCIÓN Y FACTORES DE RIESGO ASOCIADOS A
LA TRANSMISIÓN DE Anaplasma marginale EN REBAÑOS
BUFALINOS LECHEROS
Detection and risk factors associated with the transmission
of Anaplasma marginale in dairy bualo herds
Juan Pablo Uzcátegui-Varela
1*
, Armando de Jesús Briceño-Rangel
1
, María Carolina Rosales
2
,
Ender Eduardo Márquez
1
y Rosana Uzcátegui-Lara
1
.
1
Grupo de Investigación en Ciencia Animal y Plantas Tropicales. Universidad Nacional Experimental Sur del Lago
“Jesús María Semprum” (UNESUR) Núcleo La Victoria, estado Mérida, 5142, Venezuela.
2
Universidad de los Andes, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología, Laboratorio de Genética
y Química Celular (GeQuimCel), Mérida, 5101, Venezuela.
*
uzcateguij@unesur.edu.ve
RESUMEN
Anaplasma marginale es una rickettsia intracelular transmitida
por garrapatas e insectos hematófagos que infecta los eritrocitos
maduros de rumiantes, considerándose como el hemotrópico de
mayor impacto económico en los planteles lecheros del mundo.
Los hallazgos de A. marginale en búfalo (Bubalus bubalis) han
demostrado que se trata de un importante reservorio del patógeno
para los vacunos donde coexisten. Con el propósito de detectar
A. marginale en búfalas lactantes así como los factores de riesgo
(FR) asociados a su transmisión, se visitaron doce unidades de
producción ubicadas en el Eje Panamericano, Sur del Lago de
Maracaibo-Venezuela, donde se colectaron 120 muestras de
sangre a partir de la vena yugular utilizando tubos al vacío con
anticoagulante ácido etilendiamino tetraacético (EDTA). El ADN
obtenido fue puricado según el método de la proteinasa K y
fenol-cloroformo para identicar mediante la técnica de Reacción
en Cadena de la Polimerasa (PCR), un gen especico (msp1)
para A. marginale. Por otra parte, se visualizó la presencia del
patógeno a través del extendido sanguíneo bajo microscopio
(100X) con tinción de Giemsa y, se aplicó un cuestionario
epizootiológico para registrar los elementos epidemiológicos
anes con la transmisión del microorganismo rickettsial. La
PCR reveló la presencia de un amplicón especíco para A.
marginale de aproximadamente 400pb en 80% (96/120) del total
de búfalas muestreadas; en cambio, por extendido sanguíneo
solo el 25,83% (31/120) de los animales se diagnosticaron
positivos. Entre los FR estudiados, la presencia de garrapatas
(Rhipicephalus microplus) representó el de mayor impacto
negativo (Odds ratio (OR)=3,23), mientras que el uso de baños
acaricidas resultó una práctica de protección (OR=0,83) ante A.
marginale. En conclusión, la PCR demostró ser una herramienta
de diagnóstico sensible y especica en comparación con el frotis
sanguíneo para hallar A. marginale. La alta positividad entre los
rebaños demandan la adopción de estrategias sanitarias para el
control de A. marginale en B. bubalis.
Palabras clave: Anaplasma marginale; búfalos; factores de
riesgo; PCR
ABSTRACT
Anaplasma marginale is an intracellular rickettsia transmitted
by ticks and hematophagous insects that infect the mature
erythrocytes of ruminants, being considered as the hemotropic
of greater economic impact in the dairy farms of the world. The
ndings of A. marginale in bualo (Bubalus bubalis) have shown
that it is an important reservoir of the pathogen for cattle where
they coexist. In order to detect A. marginale in lactating bualoes
as well as the risk factors (RF) associated with its transmission,
twelve production units located in the Eje Panamericano, Sur
del Lago de Maracaibo-Venezuela were visited. Collected 120
blood samples from the jugular vein using vacuum tubes with
anticoagulant ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA). The DNA
obtained was puried according to the method of proteinase K
and phenol-chloroform to identify by means of the Polymerase
Chain Reaction (PCR) technique, a specic gene (msp1) for A.
marginale. On the other hand, the presence of the pathogen was
visualized through the blood smear under a microscope (100X)
with Giemsa stain, and an epizootiological questionnaire was
applied to register the epidemiological elements related to the
transmission of the rickettsial microorganism. PCR revealed the
presence of a specic amplicon for A. marginale of approximately
400 bp in 80% (96/120) of the total of bualoes sampled; however,
by extended blood only 30% (36/120) of the animals were
diagnosed as positive. Among the FR studied, the presence of
ticks (Rhipicephalus microplus) represented the highest negative
impact (Odds ratio (OR) = 3.23), while the use of acaricide
baths was a protection practice (OR = 0.83) for
A. marginale. In
conclusion, PCR proved to be a sensitive and specic diagnostic
tool compared to the extended blood to nd A. marginale. The
high positivity among herds demand the adoption of sanitary
strategies for the control of A. marginale in B. bubalis.
Key words: Anaplasma marginale; bualoes; risk factors; PCR
Recibido: 02/01/2019 Aceptado: 12/12/2019
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Detección y factores de riesgo / Uzcátegui-Varela, JP. y col.
INTRODUCCIÓN
Anaplasma marginale es un conocido patógeno rickettsial
intraeritrocítico que infecta a una gran variedad de rumiantes,
incluidos búfalos (Bubalus bubalis), causando anemia, ictericia,
ebre, abortos y muerte en rebaños comerciales de zonas
tropicales y subtropicales del mundo [14, 28]. Una vez infectados,
los animales siguen siendo portadores de por vida, lo cual
representa un serio problema económico para la ganadería de
los países en desarrollo [14]. La transmisión de A. marginale
se lleva a cabo principalmente por garrapatas (Rhipicephalus
microplus), las cuales al igual que los hospedadores, se infectan
persistentemente y sirven como reservorios de infección [26]. Se
ha reconocido que el búfalo de agua (B. bubalis) es susceptible
a la infección por A. marginale, pero los hallazgos clínicos son
difícilmente detectables en comparación al vacuno, convirtiéndolo
en un portador asintomático que pone en riesgo la salud de
rebaños Bos indicus y B. taurus cercanos [10]; es así como los
búfalos infectados al ingresar a zonas no endémicas o unidades
de producción (UP) con reducida presencia de A. marginale,
podrían introducir nuevas cepas e incrementar su prevalencia
en hospedadores altamente susceptibles [35]. Son escasos los
estudios reportados sobre anaplasmosis en ganado bufalino del
trópico americano, sin embargo, se conoce que la prevalencia en
B. bubalis es inferior a la observada en bovinos [38]. El método
convencional para detectar A. marginale se basa en la evaluación
morfológica de los eritrocitos a través del microscopio mediante
un extendido sanguíneo; pero debido a la baja rickettsemia
presente en animales asintomáticos como B. bubalis, este
método no se recomienda para la detección subclínica de A.
marginale, razón por la cual son utilizadas pruebas serológicas de
mayor especicidad como inmunouorescencia indirecta, prueba
de inmunoadsorción ligada a enzimas (ELISA) indirecto y la
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) [35]. Al respecto, es
evidente la ventaja competitiva que presenta la PCR en términos
de reproducibilidad, sensibilidad e interpretación, pues se logra
identicar el ácido desoxirribonucleico (ADN) especíco del
microorganismo patógeno en sangre, minimizando el diagnóstico
de falsos negativos en animales infectados sub-clínicamente
[10, 35]. En vista que B. bubalis es refractario a enfermedades
hemotrópicas, favoreciendo las infecciones oportunistas por A.
marginale en zonas ganaderas donde coexiste con el vacuno
y, que se han reportado algunos factores de riesgo asociados
a la transmisión de A. marginale en zonas rurales de Venezuela
debido a las condiciones climáticas propias de la selva húmeda
tropical, se planteó como objetivo detectar mediante PCR, la
presencia de A. marginale en búfalas lactantes aparentemente
sanas en el Eje Panamericano del Sur del Lago de Maracaibo,
estados Mérida y Zulia-Venezuela, así como la identicación
de los factores de riesgo más relevantes en la transmisión del
microorganismo rickettsial.
MATERIALES Y MÉTODOS
Área de estudio: Se visitaron 12 UP dedicadas a la producción
bufalina lechera ubicadas en una zona de vida clasicada como
selva húmeda tropical (SHT) [31] en el Eje Panamericano-Sur del
Lago de Maracaibo (estados Mérida y Zulia) a 120 metros sobre
el nivel del mar (m.s.n.m.), temperatura media de 36 °C y 85% de
humedad relativa, según el reporte electrónico de una estación
meteorológica móvil (Celestron®-EUA) y un GPS (GARMIN®
modelo Etrex 10 Lcd. 2.2-EUA).
Muestreo: El tamaño mínimo de la muestra se determinó
mediante la fórmula para estudios de prevalencia propuesta
por el Centro Panamericano de Zoonosis citada por Silva y
col. [38]: N= p(100-p)(Z)
2
/(d.p/100)
2
. El valor de prevalencia
esperada (p) se estimó en 75% de acuerdo a lo expuesto por
Tamasaukas y col. [41] como valor promedio registrado entre
ncas ganaderas doble propósito en Venezuela; por su parte,
el porcentaje correspondiente a conanza (Z) fue de 95% y, el
margen de error (d) 5% según lo recomendado por González y
Meléndez [18] y Silva y col. [38]. Un total de 120 búfalas adultas
lactantes, todas ubicadas en el primer tercio de lactancia, con
registro máximo de tres partos, mestizas Murrah x Mediterráneo
y de excelente condición corporal fueron consideradas para
el presente estudio. Se seleccionaron diez animales por nca
a los cuales se les extrajo individualmente 6 mililitros (mL) de
sangre mediante punción de la vena yugular, utilizando agujas
de calibre 21 G x 1” (0,8 milimetros (mm) x 25 mm) en tubos
estériles al vacío (Vacuum Diagnostics®) con anticoagulante
ácido etileno diamino tetra-acético (EDTA, 35 microlitros (μL))
debidamente rotulados y posteriormente refrigerados a -20 °C
en un congelador de laboratorio serie GP Freezer capacidad 962
litros (L) modelo MF25SS-SAEE-TS marca Thermo Scientic®-
EUA hasta su procesamiento [1, 3, 34, 37]. Durante el muestreo
se colectaron ectoparásitos junto con el pelo en orejas y cuello de
las búfalas estudiadas para su identicación morfológica según la
metodología descrita por Batista y col. [6] y Veneziano y col. [44],
por ser considerados como un factor de riesgo en la transmisión
de A. marginale.
Recolección de datos: De acuerdo a experiencias
epidemiológicas previas [38], se diseñó un cuestionario
epizootiológico basado en criterios sobre la transmisión de
A. marginale expuestos por Kessler [23]. La encuesta estuvo
estructurada en función de preguntas objetivas con el propósito
de recopilar información sobre los factores de riesgo (FR)
asociados a la presencia de A. marginale en los rebaños. Para
el presente trabajo, los FR seleccionados fueron: presencia de
garrapatas, hallazgo de insectos hematófagos (Haematopinus
tuberculatus), uso colectivo de agujas (transmisión iatrogénica),
aplicación de soluciones tópicas acaricidas y desparasitación con
ivermectina [39].
Extendido sanguíneo: Las muestras al ser colectadas se
sometieron a identicación hematológica bajo el protocolo
clásico de laboratorio clínico, el cual consistió en tomar 5 μL
de sangre venosa para el frotis, luego se realizó la jación
con metanol absoluto durante 5 minutos (min) y, nalmente se
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Revista Cientíca, FVC-LUZ / Vol. XXIX, 4, 265 - 273, 2019
efectuó la tinción con Giemsa (1/10 en agua destilada, 30 min).
Para la visualización de los eritrocitos, se empleó un microscopio
Leica®-China modelo CME (100X), en busca de corpúsculos de
inclusión compatibles con A. marginale [7, 29] y, luego respaldar
la detección del patógeno mediante PCR.
Extracción de ácido desoxirribonucleico (ADN): Se realizó
una corrida electroforética previa para validar la calidad del ADN
utilizando muestra serológica humana y de búfalo. La sangre
colectada fue procesada según el protocolo de aislamiento
de ADN con proteinasa K y fenol-cloroformo de Sambrook y
Russell [36] modicado en este trabajo. Las muestras fueron
descongeladas durante 1 hora (h) a temperatura ambiente,
mezclándolas suavemente por inversión. A 500 μL de sangre
se le agregó 500μL de buer de lisis (Tris-Cl 10mM, pH 8; EDTA
0,1M, SDS 0,5%; DNasa libre de RNasa, 20 microgramo (μg )/
mililitro(mL)) la cual fue agregada al momento de usar y luego
se incubó a 37
o
C por 1 h utilizando un termobloque modelo
Mastercycler nexus gradient Eppendorf®-Alemania. Se colocó
proteinasa K a una concentración nal de 100 μg/mL usando
una solución stock de 20 mg/mL. Se agitó e incubó por 3 h a 50
o
C (hubo agitación esporádica durante la incubación); superada
la incubación se extrajo un volumen de fenol: cloroformo (1:1)
equilibrado con buer Tris-Cl pH 8, agitándose vigorosamente
por 3 min hasta formar una emulsión. Se centrifugó a 21.912 G
(Fuerza centrífuga relativa (RCF)) por 15 min a 4°C utilizando
una microcentrífuga Eppendorf® 5427R-Alemania. En este
paso solo se observaron dos fases, una cristalina y una fase
blanca superior. Se agregó 500µL de buer de lisis adicional, se
agitó vigorosamente para homogenizar las fases y se repitió la
centrifugación para recuperar la fase acuosa en un tubo nuevo
estéril. Se realizó una extracción con un volumen 1:1 de cloroformo
(de acuerdo al volumen recuperado), se agitó vigorosamente y se
repitió la centrifugación. De nuevo se recuperó la fase acuosa y
se colocó 0,2 volúmenes de acetato de amonio 10 Molar (M) y dos
volúmenes de etanol absoluto. Se mantuvo la solución a -20°C
para precipitar el ADN. Nuevamente se centrifugó y descartó el
sobrenadante, seguidamente se lavó la pastilla con 0,5 mL de
etanol frío al 70% y se repitió la centrifugación. Finalizada la
centrifugación, el etanol al 70% fue descartado y el exceso del
mismo se drenó al colocar el tubo de forma invertida sobre papel
absorbente. El ADN fue rehidratado con 50µL de buer Tris-EDTA
(buer TE) y almacenado a -20°C hasta su uso. La concentración
de todos los ADN fueron estimadas espectrofotométricamente
utilizando el equipo Uvmin-1240 Shimadzu Corporation-Japón,
a 260 nanómetros (nm) según Sambrook y Russell [36] y su
integridad fue visualizada en corrida electroforética usando
una cámara Mini sub-cell
TM
Bio rad-EUA, y geles de agarosa al
0,8% con una concentración nal de bromuro de etidio de 1µg/
mL (Sigma, 10 miligramos (mg)/mL). Se cargaron por pozo 1µL
de cada ADN más 3µL de buer de carga. El tiempo de corrida
fue de 1 h en buer Tris-borate-EDTA (buer TBE) 0,5X. Luego
de la corrida, el gel fue retirado y expuesto a luz ultravioleta
y fotograado empleando el sistema de documentación y
digitalizador de imágenes Ovitec® modelo Uvipro Chemi,
Cambridge-Reino Unido.
Detección molecular de A. marginale: Para todas la mezclas
de PCR se utilizó como control negativo y positivo muestras de
ADN correspondiente a sangre de búfalos (B. bubalis) sanos y
enfermos proporcionado por el laboratorio de Biotecnología de
la Universidad Nacional Experimental Sur del Lago “Jesús María
Semprum” (UNESUR), Santa Bárbara de Zulia, estado Zulia
9°00’00’’ N; 71°55’00’’. En todas las PCR se incluyó un control
sin ADN. Las mezclas de PCR se realizaron en una cámara
de ujo laminar (Labconco® Premier-EUA) utilizando puntas
plásticas (epTIPS Box- Eppendorf®) y micro-pipetas (Eppendorf
Research plus®). Los cebadores fueron sintetizados en escala
de 50 nanomol (nmol) por EUROFINS®. Se preparó una solución
stock a 100 micromol (µM) y, una mezcla de PCR de 0,4µM.
Para la PCR de identicación se utilizaron los oligonucleótidos
BAP-2 (5´-GTATGGCACGTAGTCTTGGGATCA-3´) y AL34S
(5´-CAGCAGCAGCAAGACCTTCA-3´), que permitieron
amplicar el gen msp1 que codica una sub-unidad de la proteína
de supercie de membrana de A. marginale, generando un
amplicón de 409 pb [40]. Para todos los ADN se preparó un stock
de uso de 50ng/µL y, de cada uno de estos, se usó 1µL por tubo
de reacción para una concentración nal 3,3ng/µL. Se empleó un
termociclador marca Applied Biosystems®-EUA, modelo 2720. El
volumen de trabajo para las reacciones de PCR fue de 15 µL,
empleando 0,4mM de cada cebador y GoTaq® Green Master Mix,
2X, PROMEGA (Tampón 2X pH 8,5, dATP 400μM, dGTP 400μM,
dCTP 400μM, dTTP 400μM y MgCl
2
3mM). La mezcla GoTaq®
está diseñada para ser diluida ½. Los ADN fueron colocados en los
tubos de reacción luego de dispensar la mezcla de amplicación.
El perl térmico utilizado en el ensayo fue: 94 °C, 3 min; 94 °C,
1 min; 60 °C, 1 min; 72 °C, 30 segundos (seg) x 32 ciclos; 72
°C, 5 min [19]. Con el objeto de descartar que los resultados
negativos son por contar con ADN de baja calidad, se llevaron
a cabo amplicaciones usando un par de cebadores dirigidos
a amplicar un gen de mantenimiento celular “housekeeping”
especíco para la secuencia de ADN de la gliceraldehído
3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH), utilizándose para las PCR
los cebadores GAPDH1 (5’-GTTCCAGTATGATTCCACCC-3’) y
GAPDH2 (5’-TCCCTCCACGATGCCAAA-3’) según lo sugerido
por Homan y col. citado por Tramuta y col. [43]. La concentración
y componentes de las mezclas de reacción para la PCR y el
perl térmico utilizado en la amplicación fueron las mismas
mencionadas para el PCR de detección. De los productos
amplicados se cargaron 10 microlitro µL más 5 µL de buer
de carga por pozo. Tanto para el diagnostico como para el
“housekeeping”, las características del gel de agarosa y las
condiciones de corrida electroforética coinciden con las descritas
en el protocolo de puricación de ADN.
Análisis de datos: Se determinó la cantidad porcentual de
animales positivos a A. marginale mediante PCR y extendido
sanguíneo en cada UP. Para hallar la relación entre positividad
y FR, se planteó un diseño retrospectivo (casos y controles)
basado en la prueba de odds ratio (OR) e intervalo de conanza
268
Detección y factores de riesgo / Uzcátegui-Varela, JP. y col.
(IC=95%) para identicar la magnitud del riesgo [1, 20].
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Obtención de ADN: El protocolo de extracción utilizado [19]
y modicado en este trabajo, permitió obtener ADN íntegro
sin signos de degradación o fragmentación. Este resultado
fue conrmado al procesar por duplicado muestras de sangre
bufalina y humana fresca. Se obtuvo aproximadamente 40 µg
de ADN total a partir de 0,5 mL de sangre de búfalo (80µg ADN/
mL de sangre) y, 60µg de ADN total (120µg/mL) para sangre
humana fresca, proporcionando suciente ADN para cualquier
ensayo que implique la técnica de PCR. En la Figura (FIG.) 1
se observa una banda de ADN única por carril bien denida sin
evidencia de degradación, lo cual sugiere la obtención de ADN de
excelente calidad para el diagnóstico de A. marginale por PCR.
Para evaluar el ADN utilizado como control positivo en la PCR
durante el diagnóstico, se realizó una PCR con los cebadores
especie-especícos, logrando amplicar un amplicón que migró
con la banda de la escalera de peso molecular de 400 pb tal y
como lo reseñaron Stich y col. [40] validado por Añez-Rojas y
col. [2] y Ashuma y col. [3]. Por otra parte, al amplicar parte
del gen de la gliceraldehído deshidrogenasa (housekeepin) como
control interno de calidad del ADN, se evidenció su viabilidad
para ser amplicado, por tal razón, la no aparición de resultados
positivos en algunas muestras comprobó la ausencia del ADN
de A. marginale.
FIGURA 1. ADN EXTRAÍDO A PARTIR DE SANGRE
TOTAL. 1, 1’ y 3, 3’: muestra de sangre bufalina; 2 y 2’:
muestra de sangre humana fresca
Detección de Anaplasma marginale: La identicación
microscópica de A. marginale a partir de extendidos sanguíneos,
permitió diagnosticar 25,83% (31/120) del total de búfalas
muestreadas como positivas al microorganismo patógeno.
Al respecto Eriks y col. [15] y Kocan y col. [27] señalan que
mediante frotis sanguíneo no se logra identicar niveles por
debajo de 1x10
7
eritrocitos infectados/mL de sangre y, por tanto
se trata de una prueba denitiva sólo en fase aguda pero no
resulta sucientemente sensible para diagnosticar en animales
aparentemente sanos. Por su parte, la PCR reveló que 80%
(96/120) de los animales involucrados en el estudio resultaron
positivos a A. marginale (TABLA I), tomando como referencia
para el diagnóstico la aparición de un amplicón con un tamaño
≈ 400pb. según lo establecido por Stich y col. [40]. Se puede
observar en la corrida electroforética (FIG. 2) variaciones en la
intensidad de las bandas obtenidas de animales provenientes
de una misma UP, lo cual puede ser explicado por la presencia
de diferentes niveles de rickettsemia como lo exponen Corona
y Martínez [9]. Esta armación es apoyada por el hecho de que
todos los ADN se diluyeron a una misma concentración de uso
y, la intensidad de los amplicados para el gen de la GAPDH
fue similar para todos los aislados, indicando que las diferencias
de intensidad en la amplicación del gen msp1 posiblemente se
deben a variaciones del nivel de infestación intraeritrocitaria.
TABLA I
RESULTADOS DE DETECCIÓN DE Anaplasma marginale
MEDIANTE EXTENDIDO SANGUÍNEO Y PCR EN UNIDADES
DE PRODUCCIÓN BUFALINA DEL EJE
PANAMERICANO-SUR DEL LAGO DE MARACAIBO
UP n
Prueba diagnóstico para A. marginale
PCR Extendido sanguíneo
Positivo Negativo Positivo Negativo
A
10
6 4 2 8
B 9 1 3 7
C 9 1 4 6
D 8 2 3 7
E 7 3 2 8
F 8 2 2 8
G 8 2 2 8
H 9 1 3 7
I 8 2 2 8
J 7 3 2 8
K 9 1 3 7
L 8 2 3 7
Total 96 24 31 89
% 80,0 20,0 25,83 74,17
Diversos estudios epidemiológicos similares se han realizado
en ganadería bovina venezolana, reportándose en promedio la
presencia de A. marginale en 70% de los animales muestreados,
lo cual permitió conrmar que las condiciones ecológicas del
trópico americano favorecen la endemia para A. marginale [10,
41] y por tanto, los rebaños bufalinos que se han extendido
considerablemente por las zonas ganaderas del occidente
de Venezuela, están expuestos al hemotrópico en estudio. El
porcentaje de animales positivos a A. marginale aquí reportado
269
Revista Cientíca, FVC-LUZ / Vol. XXIX, 4, 265 - 273, 2019
es similar al calculado por Bolívar y col. [8] en una explotación
ganadera del estado Mérida ubicada en la zona Panamericana-
Sur del Lago de Maracaibo, quienes utilizando PCR como prueba
diagnóstico, hallaron A. marginale en 76,96% de las búfalas (B.
bubalis) clínicamente sanas involucradas en la investigación; por
tal motivo, estos resultados indican que el patógeno se encuentra
ampliamente distribuido en el área de estudio, considerándose
B. bubalis como un importante reservorio de A. marginale; de
igual forma 80% de los búfalos evaluados por Khan y col. [24]
resultaron positivos a A. marginale en Pakistán, exponiendo
la necesidad de desarrollar más experiencias de campo para
la detección molecular de A. marginale en B. bubalis dado
los efectos negativos que representa desde el punto de vista
sanitario su comportamiento asintomático. Sin embargo, Barbosa
da Silva y col. [5] detectaron ADN de A. marginale en 5,4% de
los búfalos muestreados al Norte de Brasil, mientras Néo [30]
reportó 68% de muestras positivas al hemotrópico mediante
PCR en búfalos jóvenes de São Paulo, Brasil. Un porcentaje
semejante concluyeron El-Hariri y col. [14] en su trabajo de
campo, al obtener 69,3% de animales positivos a A. marginale
en áreas rurales de Egipto. Si bien las condiciones climáticas
de los últimos casos mencionados son compatibles al Sur del
Lago de Maracaibo-Venezuela, el porcentaje de positividad por
ellos reportado es inferior al obtenido, la razón, según Barbosa
da Silva y col. [5] radica en el constante control de vectores
reportado por los propios investigadores durante el registro de
datos epidemiológicos.
FIGURA 2: A 2. ELECTROFORESIS CON AMPLICONES
ESPECÍFICOS PARA A. marginale. Carril 1-9: amplicones
obtenidos a partir de sangre total de búfalas lactantes positivas
a A. marginale. Carril 10: muestra negativa (búfalo sano). Carril
11: control positivo. Carril 12: marcador de peso molecular (100
pb). Carril 13: negativo (sin ADN)
A. marginale fue detectada en todos los grupos de B. bubalis
muestreados; al respecto Torioni y col. [42] explican que el alto
porcentaje de animales positivos se debe a que la infección
permanece persistente en el rebaño, donde ocurre multiplicación
cíclica (bajo nivel) de A. marginale que uctúa entre 103-107
eritrocitos infectados/mL de sangre. Según el reporte presentado
por Ashuma y col. [3], B. bubalis es un portador por excelencia de
A. marginale al no exhibir sintomatología clínica y actuando como
potencial reservorio. Para Corona y col. [10] y Jacobo y col. [21],
el diagnóstico molecular de A. marginale en grandes rumiantes
portadores resulta determinante para caracterizar el estado
epidemiológico en los rebaños con nes de monitoreo y control,
debido a que la rickettsia se expande a través del movimiento
de los animales infectados en áreas libres de la enfermedad.
Figueroa y col. [17] indican que la utilización de la PCR en la
detección de A. marginale permite avances signicativos, no solo
en el diagnóstico de anaplasmosis, sino también en estudios
epidemiológicos con resultados precisos.
Factores de riesgo asociados a la presencia de A.
marginale: Ashuma y col. [3] sugieren que, en casos donde se
reporta un alto porcentaje de animales positivos a A. marginale
es necesario evaluar los elementos sanitarios que favorecen la
transmisión del patógeno. A partir de esta premisa, al procesar
los datos generados por la encuesta epidemiológica (TABLA II),
la presencia de garrapatas (R. microplus) representó un factor
de riesgo importante (OR = 3,23; 95% Intervalo de conanza
(IC): 1,31-7,98) para la detección de A. marginale en los grupos
de búfalas muestreados. Un valor superior (OR=4,34) fue
reportado por Sharma y col. [37] al evaluar los FR asociados a
A. marginale en búfalas lactantes al norte de la India, armando
que la presencia de R. microplus adheridas al animal aumenta
en cuatro veces el riesgo de contraer A. marginale. Para Jaimes-
Dueñez y col. [22], las probabilidades de seropositividad tienden
a aumentar en presencia de artrópodos hematófagos, siendo
R. microplus el principal vector biológico de la anaplasmosis en
gran parte del trópico sudamericano [6, 23, 37]. Los hallazgos
de R. microplus en B. bubalis han sido ampliamente discutido
[33] y se ha comprobado que la baja rickettsemia en el búfalo es
suciente para infectar las garrapatas (R. microplus) e introducir
A. marginale en rebaños vacunos cercanos, los cuales son
considerablemente susceptibles a dicha bacteria intraeritrocitaria
[32]. En consecuencia, la identicación de reservorios como B.
bubalis y la mínima exposición a garrapatas son estrategias de
control importantes para la anaplasmosis. Sin embargo, Medina-
Naranjo y col. [28] al diagnosticar A. marginale en vacunos del
Ecuador, arman que la presencia o ausencia de garrapatas no
determina la positividad total del hemotrópico en los rebaños, por
lo que existen otros factores que participan directamente en la
dispersión de la rickettsia. Al igual que las garrapatas, los insectos
hematófagos identicados en B. bubalis se han relacionado
previamente como importantes vectores de A. marginale [6,
22]. Figueiredo y col. [16] arman que los piojos del orden
Anoplura representa un grupo de ectoparásitos de alto potencial
epidemiológico para la transmisión de enfermedades. Durante
la evaluación se identicaron piojos picadores Haematopinus
tuberculatus en la mayoría de búfalas, su presencia alcanzó un
considerable nivel de riesgo (OR= 1,42; 95% IC: 0,66-3,07) para la
infección de A. marginale entre las búfalas lecheras muestreadas.
Experiencias similares en Brasil discutidas por Da Silva y col.
[12] al estudiar piojos positivos a A. marginale, apuntan a que
esta vía de transmisión sea la fuente más importante para que
B. bubalis adquiera A. marginale, debido a que H. tuberculatus
270
Detección y factores de riesgo / Uzcátegui-Varela, JP. y col.
es el ectoparásito de mayor densidad poblacional reportada en
la supercie dérmica de estos animales. A partir del resultado
obtenido se evidencia que la infestación del piojo H. tuberculatus
en búfalos merece atención (OR>1) sanitaria por considerarse
un vector de amplio alcance para la anaplasmosis en ganadería
bufalina.
Otra forma frecuente de transmitir A. marginale es mediante el
uso de fómites con sangre contaminada durante vacunaciones,
transfusiones sanguíneas e intervenciones quirúrgicas [23].
Al evaluar el efecto del uso de una aguja colectiva, ésta se
consideró como un factor de riesgo (OR=1,10; 95% IC: 0,81-
1,35) importante para la trasmisión de A. marginale en las
explotaciones bufalinas visitadas. Al respecto Reinbold y col.
[34] recomiendan al operario ser precavido durante las prácticas
de control sanitario para evitar la inoculación injusticada de
ganado, debido a que hay experiencias que reportan hasta 60%
de animales positivos a A. marginale al utilizar material infectado
experimentalmente. Sin embargo, se ha documentado que el
estudio sobre la transmisión iatrogénica de anaplasmosis no es
precisa sobre el número de animales que podrían infectarse con
una inyección secuencial utilizando una única aguja [4].
En cuanto al uso frecuente de soluciones acaricidas tópicas
(baños), se consideró como un elemento protector (OR= 0,83;
95% IC: 0,39-1,78) frente a la infección de A. marginale en los
rebaños bufalinos evaluados, debido al efecto control que ejerce
sobre las poblaciones de R. microplus y H. tuberculatus, ambos
ectoparásitos asociados a la transmisión efectiva de A. marginale.
Al respecto Da Silva [13] arma que la regularidad en el uso de
acaricidas garantiza en gran medida la ausencia de A. marginale
en vacunos de la zona alta brasileña; de igual forma Kispotta
y col. [25] reportan un efecto satisfactorio del uso de baños
acaricidas (OR=0,23) en el control de A. marginale de bovinos al
sur de Asia. En B. bubalis igualmente se recomienda la aplicación
de acaricidas como tratamiento efectivo contra ectoparásitos por
ser transmisores de numerosos agentes etiológicos perjudiciales
para la salud animal [11]. Finalmente, el empleo de ivermectinas
como tratamiento antihelmíntico y ectoparasiticida en B. bubalis
resultó un factor de riesgo (OR=1,16; 95% IC: 0,53-2,55)
asociado a la positividad de A. marginale, tomando en cuenta
que gran parte de la ganadería bubalina del trópico americano
utiliza el fármaco [5]; sin embargo, investigaciones realizadas
por Kispotta y col. [25] y Kocan [26], concluyeron que el uso de
ivermectinas no inuye sobre la positividad a A. marginale; más
bien, la droga afecta el desarrollo de la garrapata sin generar
efecto sobre el hemotrópico, favoreciendo la prevalencia de A.
marginale a través de otros vectores resistentes.
CONCLUSIONES
En función de los hallazgos aquí reportados, la PCR demostró
ser una herramienta acertada para el diagnóstico de A. marginale
en ganado bufalino lechero debido a su alta sensibilidad y
especicidad en comparación con el extendido sanguíneo. El alto
porcentaje de hembras B. bubalis clínicamente sanas positivas
a A. marginale, contribuyen a una mejor comprensión de los
aspectos epidemiológicos del patógeno en la zona abordada,
tomando en cuenta que los factores de riesgo de mayor
impacto para la infección de A. marginale fue la presencia de
R. microplus y H. tuberculatus, resultando el control de vectores
como la práctica de manejo sanitario más efectiva para reducir el
TABLA II
FACTORES DE RIESGO ASOCIADOS A LA PRESENCIA DE Anaplasma marginale EN REBAÑOS BUFALINOS LECHEROS
Factor de riesgo N
*
OR
**
IC (95%)
***
Presencia de garrapatas
Sí
No
77
43
3,23 1,31-7,98
Presencia de insectos hematófagos
Si
No
75
45
1,42 0,66-3,07
Uso de agujas contaminadas
Si
No
110
10
1,10 0,81-1,35
Aplicación de acaricidas tópicos
Regular
Irregular
90
30
0,83 0,39-1,78
Ivermectina como tratamiento antihelmíntico
Si
No
70
50
1,16 0,53-2,55
*
Cada factor de riesgo fue cotejado en 120 animales
**
Odds ratio
***
α=5%
271
Revista Cientíca, FVC-LUZ / Vol. XXIX, 4, 265 - 273, 2019
porcentaje de positividad a A. marginale. Finalmente se evidencia
que B. bubalis puede actuar como un importante reservorio del
hemotrópico para los vacunos establecidos en la zona.
AGRADECIMIENTO
El presente aporte cientíco contó con el apoyo y participación
de productores agropecuarios dedicados a la comercialización
de leche cruda bufalina en el Eje Panamericano-Sur del Lago
de Maracaibo, Venezuela. Los autores igualmente expresan
su gratitud a los laboratorios de Biología Molecular del
Instituto Nacional de Investigaciones Agrícolas (INIA)-Mérida
y Fitobiotecnología de la Facultad de Ciencias, Universidad de
los Andes-Mérida, Venezuela por el apoyo instrumental ofrecido
durante la ejecución del trabajo.
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