1016
Rev. Fac. Agron. (LUZ). 2021, 38(4): 1016-1034. Octubre-Diciembre.
DOI: https://doi.org/10.47280/RevFacAgron(LUZ).v38.n4.15 ISSN 2477-9407
Esta publicación científica en formato digital es continuación de la Revista Impresa: Depósito legal pp 196802ZU42, ISSN 0378-7818.
Recibido: 19-11-2020 . Aceptado: 09-03-2021.
*Autor de correspondencia. Correo electrónico: ymendezm@uteq.edu.ec
Respuesta bioquímica e inmune en tilapia roja
(Oreochromis mossambicus × O. niloticus) con
suplementación de quitosano en dieta
Biochemical and immune response in red tilapia
(Oreochromis mossambicus × O. niloticus) with dietary
chitosan supplementation
Resposta bioquímica e imune em tilápia vermelha
(Oreochromis mossambicus × O. niloticus) com
suplementação de quitosana na dieta
Yuniel Méndez-Martínez
1
*, Ginger K. Pacheco-Morales
1
,
Karla A. Del Barco-Ibarra
1
, Yenny G. Torres-Navarrete
1
y
Martha P. Hernández-Vergara
2
.
1
Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad Técnica Estatal de Quevedo (UTEQ),
Quevedo, Los Ríos, Ecuador. Correos electrónicos: (YM) ymendezm@uteq.edu.ec, , (GP)
ginger.pacheco2014@uteq.edu.ec, , (KD) karla.delbarco2014@uteq.edu.ec, , (YT)
ytorres@uteq.edu.ec, ;
2
División de Estudios de Posgrado e Investigación, Instituto
Tecnológico de Boca del Río, Boca del Río, Veracruz, México. Correos electrónicos: (MH)
mphv1@yahoo.com.mx, .
Resumen
El uso de bioestimulantes en dietas para peces es una estrategia prometedora
para reducir el uso de antibióticos, potenciar la respuesta bioquímica e inmune,
lo cual contribuye a mejorar rendimientos productivos y disminuir las pérdidas
económicas. Se evaluó la respuesta bioquímica e inmune en juveniles de tilapia
roja (Oreochromis mossambicus × O. niloticus), con diferentes niveles: 0 (control),
1, 2, 3, 4 y 5 % de quitosano en dieta. Se sembraron 270 animales (7,53 ± 0,50 g de
peso inicial), distribuidos en un diseño completamente al azar de 6 tratamientos
con 3 réplicas y 45 tilapias.tratamiento
-1
, en 18 tanques con 90 L de agua en sistema
cerrado. Los juveniles se alimentaron durante 55 días con las dietas experimentales
y al nal del bioensayo se tomaron las muestras de tejidos y plasma sanguíneo.
Se encontraron diferencias (p<0,05) en las variables respuestas evaluadas, donde
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el contenido de lípidos, triglicéridos, colesterol, hidratos de carbono y glucosa
mostraron mayores niveles (p<0,05) a concentraciones de quitosano más bajos.
Sin embargo, para contenidos de proteínas se encontró mejor respuesta (p<0,05)
a mayores niveles de quitosano en dieta. Con respecto a la materia seca y ceniza
no se encontró diferencias (p<0,05). Mientras que la superóxido dismutasa y los
leucocitos se encontraron en mayor concentración (p<0,05) cuando se suplementa
con quitosano en un 3 y 4 %. Se concluyó que la respuesta bioquímica e inmune de
juveniles de tilapia roja se favoreció con la suplementación de quitosano en dieta.
Palabras claves: glucosa, inmunoestimulantes, leucocitos, proteínas, superóxido
dismutasa, triglicéridos.
Abstract
The use of biostimulants in sh diets is a promising strategy to reduce the use
of antibiotics, enhance the biochemical and immune response, which contributes
to improving productive yields and reducing economic losses. The biochemical and
immune response was evaluated in juvenile red tilapia (Oreochromis mossambicus
×
O. niloticus), with different levels: 0 (control), 1, 2, 3, 4 and 5% chitosan in
diet. 270 animals (7.53 ± 0.50 g of initial weight), distributed in a completely
randomized design of 6 treatments with 3 replicates and 45 tilapia.treatment
-1
,
were sown in 18 tanks with 90 L of water in a closed system. The juveniles were
fed for 55 days with the experimental diets and at the end of the bioassay the
tissue and blood plasma samples were taken. Differences were found (p<0.05)
in the variables evaluated responses, where the content of lipids, triglycerides,
cholesterol, carbohydrates and glucose showed higher levels (p<0.05) at lower
chitosan concentrations. However, for protein content, a better response (p<0.05)
was found at higher levels of chitosan in the diet. Regarding dry matter and ash,
no differences were found (p<0.05). While superoxide dismutase and leukocytes
were found in higher concentration (p<0.05) when supplemented with chitosan by
3 and 4%. It was concluded that the juvenile biochemical and immune response of
red tilapia was favored with dietary chitosan supplementation.
Keywords: glucose, immunostimulant, leukocytes, protein, superoxide
dismutase, triglycerides.
Resumo
O uso de bioestimulantes na dieta de peixes é uma estratégia promissora para
reduzir o uso de antibióticos, potencializar a resposta bioquímica e imunológica,
o que contribui para melhorar os rendimentos produtivos e reduzir as perdas
econômicas. A resposta bioquímica e imune foi avaliada em juvenis de tilápia
vermelha (
Oreochromis mossambicus × O. niloticus), com diferentes níveis: 0
(controle), 1, 2, 3, 4 e 5% de quitosana na dieta. 270 animais (7,53 ± 0,50 g de
peso inicial), distribuídos em um delineamento inteiramente casualizado de 6
tratamentos com 3 repetições e 45 tilápias.tratamento
-1
, foram semeados em 18
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tanques com 90 L de água em sistema fechado. Os juvenis foram alimentados
por 55 dias com as dietas experimentais e ao nal do bioensaio foram coletadas
amostras de tecido e plasma sanguíneo. Foram encontradas diferenças (p<0,05)
nas variáveis de resposta avaliadas, onde os teores de lipídios, triglicerídeos,
colesterol, carboidratos e glicose apresentaram níveis mais elevados (p<0,05) nas
menores concentrações de quitosana. No entanto, para o teor de proteína, uma
melhor resposta (p<0,05) foi encontrada em níveis mais elevados de quitosana
na dieta. Em relação à matéria seca e cinzas, não foram encontradas diferenças
(p<0,05). Já a superóxido dismutase e os leucócitos foram encontrados em maior
concentração (p<0,05) quando suplementados com quitosana a 3 e 4%. Concluiu-
se que a resposta bioquímica e imune juvenil da tilápia vermelha foi favorecida
com a suplementação de quitosana na dieta.
Palavras-chave: glicose, imunoestimulante, leucócitos, proteína, superóxido
dismutase, triglicerídeos.
Introducción
La acuicultura creció de manera
exponencial en los últimos 50 años,
partiendo de una producción de menos
de 1 millón de toneladas (t) en 1950 a
más de 90 millones t a nivel mundial
en los últimos años (FAO, 2020). Uno
de los principales factores que incide
en el éxito de esta industria es la
selección de especies con alto potencial
productivo, las cuales son ricas en
proteínas y variedad de ácidos grasos
insaturados (Jim et al., 2017), tal es
el caso de la tilapia roja, de la cual
existen híbridos como Oreochromis
mossambicus × O. niloticus (Méndez-
Martínez et al., 2019).
En Ecuador, la tilapia roja se
introdujo en 1993, y es la segunda
especie de importancia en la
acuicultura después del camarón
blanco (Litopenaeus vannamei), donde
el cultivo comercial nace a partir de la
aparición del virus de la mancha blanca
que afectó la producción camaronera,
dejando infraestructuras disponibles.
Introduction
Aquaculture has grown
exponentially in the last 50 years,
from a production of less than 1
million tons (t) in 1950 to more than
90 million tons worldwide in recent
years (FAO, 2020). One of the main
factors that affects the success of this
industry is the selection of species
with high productive potential, which
are rich in proteins and a variety of
unsaturated fatty acids (Jim et al.,
2017), such is the case of red tilapia,
of which there are hybrids such
as Oreochromis mossambicus
× O.
niloticus (Méndez-Martínez et al.,
2019).
In Ecuador, red tilapia was
introduced in 1993, and is the second
most important species in aquaculture
after white shrimp (Litopenaeus
vannamei), where the commercial
culture was born from the appearance
of the white spot virus that affected
production. shrimp farm, leaving
infrastructures available.
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En la actualidad, la tilapia
se cultiva en sistemas intensivos
y semintensivos donde los
requerimientos nutricionales son
satisfechos con dietas articiales;
pero debido a las condiciones de
cultivo como las altas densidades de
siembra y limitada calidad de agua,
promueve que los organismos se
encuentran sujetos a estrés constante
que se traduce en bajas tasas de
crecimiento, ineciencia alimenticia
y bajas supervivencias (Lara-Flores et
al., 2003; Al-Sagheer et al., 2018), lo
cual a su vez ha provocado brotes de
patógenos e infecciones que conllevan
daño sustancial al rendimiento (Brum
et al., 2017). Se encontró que el estrés
oxidativo en los peces puede producir
leucopenia y cambios en la fórmula
leucocitaria (Biller yTakahashi, 2018),
además de efectos en células y tejidos
de mutagénesis y carcinogénesis
(Malachy et al., 2017).
Entre los factores limitantes de las
producciones acuícolas está la carencia
de herramientas inmunoterapeúticas
prolácticas que reduzcan el efecto
de enfermedades en los diferentes
cultivos (Kumari y Sahoo, 2006, Brum
et al., 2017), que favorezcan no solo las
funciones del sistema inmunológico,
sino también los factores metabólicos,
tasa de crecimiento (Heo et al., 2001;
Fadl et al., 2020) y sean amigables con
el medio ambiente.
Los inmunoestimulantes pueden
activar respuestas inmunes no especícas
y/o especícas, donde los mecanismos de
defensa incluyen procesos metabólicos
antioxidantes no enzimáticos y
enzimáticos cuyas funciones pueden
depender de cantidades óptimas
At present, tilapia is cultivated in
intensive and semi-intensive systems
where nutritional requirements are
satised with articial diets; but due
to the cultivation conditions such as
high planting densities and limited
water quality, it promotes that
organisms are subject to constant
stress that translates into low growth
rates, nutritional inefciency and low
survival rates (Lara-Flores et al. , 2003;
Al-Sagheer et al., 2018), which in turn
has caused outbreaks of pathogens
and infections that lead to substantial
damage to yield (Brum et al., 2017). It
was found that oxidative stress in sh
can produce leukopenia and changes
in the leukocyte formula (Biller and
Takahashi, 2018), as well as effects on
cells and tissues of mutagenesis and
carcinogenesis (Malachy et al., 2017).
Among the limiting factors of
aquaculture productions is the lack
of prophylactic immunotherapeutic
tools that reduce the effect of
diseases in different crops (Kumari
and Sahoo, 2006, Brum et al., 2017),
which favor not only the functions
of the immune system, but also
metabolic factors, growth rate (Heo
et al., 2001; Fadl et al., 2020) and are
friendly to the environment.
Immunostimulants can activate
non-specic and/or specic
immune responses, where defense
mechanisms include non-enzymatic
and enzymatic antioxidant
metabolic processes whose functions
may depend on optimal amounts
of immunostimulants to express
these types of responses against
stressful conditions or the presence
of pathogens (Mehana et al., 2015;
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de inmunoestimulantes para
expresar este tipo de respuestas
contra condiciones estresantes o
presencia de patógenos (Mehana
et al., 2015; Abdel-Ghany y Salem,
2019). Además de considerarse una
estrategia prometedora para reducir
el uso de antibióticos y productos
quimioterapeúticos, potenciar la
respuesta productiva y disminuir las
pérdidas económicas (Lara-Flores et
al., 2003; Al-Sagheer et al., 2018).
En este sentido, el quitosano se ha
convertido en candidato, dado que es
polisacárido alcalino natural (b-1,4-
N-acetilglucosamina) con cargas
positivas más abundantes (Alishahi y
Aider, 2012: Ngo y Kim, 2014; Abdel-
Ghany y Salem, 2019); biodegradable
no tóxico, que contiene grupos amino e
hidroxilo y tiene diversas propiedades:
hemostática, antiinamatorio,
actividad antitumoral, actividad
antimicrobiana, actividad
hipoglucémica e hipo colesterol y
un efecto estimulador catabólico y
anabólico (Pérez et al., 2014; Mahmoud
et al., 2017; Udo et al., 2018).
Se documentó la actividad
bioestimuladora del quitosano en
trucha arcoiris (Oncorhynchus mykiss)
(Sakai et al., 1992), dorada (Sparus
aurata) (Esteban et al., 2001), lubina
juvenil (Dicentrarchus labrax) (Zaki et
al., 2015), Labeo rohita (Mastan, 2015),
y bagre africano (Clarias gariepinus)
(Udo et al., 2018). Sin embargo, el
efecto del quitosano en la dieta sobre
aspectos bioquímicos e inmunes en
tilapia no ha recibido mucha atención.
La presente propuesta se desarrolló
para evaluar la respuesta bioquímica
e inmune en juveniles de tilapia roja
Abdel-Ghany and Salem, 2019).
In addition to being considered a
promising strategy to reduce the use
of antibiotics and chemotherapeutic
products, enhance the productive
response and reduce economic losses
(Lara-Flores et al., 2003; Al-Sagheer
et al., 2018).
In this sense, chitosan has become
a candidate, since it is a natural
alkaline polysaccharide (b-1,4-
N-acetylglucosamine) with more
abundant positive charges (Alishahi
and Aider, 2012: Ngo and Kim, 2014;
Abdel-Ghany and Salem, 2019);
non-toxic, biodegradable, containing
amino and hydroxyl groups and has
various properties: hemostatic, anti-
inammatory, antitumor activity,
antimicrobial activity, hypoglycemic
and hypo-cholesterol activity, and a
catabolic and anabolic stimulatory
effect (Pérez et al., 2014; Mahmoud
et al., 2017; Udo et al., 2018).
T
he biostimulatory activity of
chitosan was documented in rainbow
trout (Oncorhynchus mykiss) (Sakai
et al., 1992), sea bream (Sparus
aurata) (Esteban et al., 2001),
juvenile sea bass (Dicentrarchus
labrax) (Zaki et al., 2015), Labeo
rohita (Mastan, 2015), and African
catsh (Clarias gariepinus) (Udo
et al., 2018). However, the effect of
dietary chitosan on biochemical and
immune aspects in tilapia has not
received much attention. The present
proposal was developed to evaluate
the biochemical and immune response
in juvenile red tilapia (
Oreochromis
mossambicus
× O. niloticus), with the
supplementation of different levels of
chitosan in the diet.
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(Oreochromis mossambicus × O.
niloticus), con la suplementación de
diferentes niveles de quitosano en la
dieta.
Materiales y métodos
Formulación y elaboración de
dietas experimentales
En el presente estudio, todas
las dietas (cuadro 1) se formularon
(LINDO Systems, Inc. IL, USA), y la
suplementación de diferentes niveles
de quitosano: 0 (control), 1, 2, 3, 4 y
5 %, para un total de 6 tratamientos.
Todos los ingredientes se tamizaron
con un tamiz de malla de 250 µm y
se pesaron con una balanza digital
(0,01 g; PE 3600 Mettler-Toledo, OH,
USA). Para cada dieta se mezclaron
todos los macroingredientes en
una mezcladora industrial (Hobart
20 Qt-A200, OH, USA) hasta
obtener una mezcla uniforme. Los
microingredientes se mezclaron
en un recipiente plástico antes de
agregarlos a la mezcla. La lecitina
de soja y aceite de pescado se
mezclaron hasta obtener una mezcla
homogénea y luego se agregó agua
con un equivalente al 30 % por peso
de los ingredientes. El alimento
fue peletizado con una picadora de
carne (Tor-Rey MJ22 JR, N L, MX)
para obtener gránulos de 2 mm, que
luego se secaron durante 8 h a 45 °C
en un horno de ujo de aire (Hafo
Serie 1600, Sheldon Manufacturing
Cornelius, OR), luego los pellets
secos se envasaron en bolsas
plásticas y se mantuvieron a -4 °C
hasta su uso (Méndez-Martínez et
al., 2019, 2021).
Materials and methods
Formulation and elaboration
of experimental diets
In the present study, all the diets
(Table 1) were formulated (LINDO
Systems, Inc. IL, USA), and the
supplementation of different levels
of chitosan: 0 (control), 1, 2, 3, 4 and
5 %, for a total of 6 treatments. All
ingredients were sieved with a 250 µm
mesh sieve and weighed with a digital
scale (0.01 g; PE 3600 Mettler-Toledo,
OH, USA). For each diet, all the
macro ingredients were mixed in an
industrial mixer (Hobart 20 Qt-A200,
OH, USA) until a uniform mixture
was obtained. The micro-ingredients
were mixed in a plastic container
before adding to the mix. The soy
lecithin and sh oil were mixed until
a homogeneous mixture was obtained
and then water was added with an
equivalent of 30 % by weight of the
ingredients. The food was pelleted
with a meat grinder (Tor-Rey MJ22
JR, NL, MX) to obtain 2 mm granules,
which were then dried for 8 h at 45 °C
in an air ow oven (Hafo 1600 Series,
Sheldon Manufacturing Cornelius,
OR), then the dry pellets were packed
in plastic bags and kept at -4 °C until
use (Méndez-Martínez et al., 2019,
2021).
Fish culture conditions
Red tilapia juveniles (7.53 ±
0.50g) were obtained from the Fish
Culture Program and transferred
to the Aquaculture Laboratory of
the Faculty of Agricultural Sciences
(01°03’18”S, 79°25´24”W) of the
Universidad Técnica Estatal de
Quevedo (UTEQ), respectively. For a
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Cuadro 1. Formulación y composición química de dietas experimentales
con suplementación de quitosano.
Table 1. Formulation and chemical composition of experimental diets
with chitosan supplementation.
Ingredientes
Niveles de quitosano en dietas (%)
0 1 2 3 4 5
Harina de pescado
1
46,50 46,50 46,50 46,50 46,50 47,00
Pasta de soya
2
28,00 28,00 28,00 28,00 28,00 28,00
Harina de trigo
3
13,90 13,90 13,90 13,40 12,90 11,90
Harina de maíz
3
4,00 3,00 2,00 1,50 1,00 0,50
Quitosano
4
0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00
Lecitina de Soya
3
1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00
Aceite de pescado
5
1,50 1,50 1,50 1,50 1,50 1,50
Alginato de sodio
6
2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00
Premezclas minerales
3
* 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00
Premezclas vitamínicas
3
** 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00
Vitamina C
3
0,10 0,10 0,10 0,10 0,10 0,10
Composición proximal real (% Materia Seca)
Materia seca 94,68 93,77 94,02 94,28 93,80 93,99
Ceniza 8,20 9,30 10,10 10,22 12,01 9,80
Grasa 7,15 7,24 8,01 7,84 7,18 8,02
Proteína 32,07 32,22 32,47 32,30 32,22 32,17
Fibra
5,63 5,86 5,92 6,18 6,66 6,81
E. L. N. N
†
18,38 18,18 18,22 18,11 17,57 18,10
Energía bruta (kJ.g
-1
)
‡
46,95 45,38 43,50 43,46 41,93 43,20
1
Comercial El Gordillo, Santo Domingo de los Tsáchilas, Ecuador.
2
Valencia- Avícola, Valencia, Ecuador.
3
Supermaxi,
Quevedo, Ecuador,
4
Expectrocrom, Guayaquil, Ecuador.
5
Productos Pesqueros S.A, Manta, Ecuador.
6
Suministros
AZ, La Paz, México. *mg.kg
-1
: Sulfato de magnesio 5,1; Cloruro de sodio 2,4; Cloruro de potasio 2; Sulfato ferroso 1;
Sulfato de zinc 0,2; Sulfato cúprico 0,0314; Sulfato manganoso 0,1015; Sulfato de cobalto 0,0191; Yodato de calcio 0,0118;
Cloruro de cloro 0,051. **mg.kg
-1
: Tiamina 60; Rivoavina 25; Niacina 40; Vitamina B6 50; Ácido pantoténico 75; Biotina
1; Folato 10; Vitamina B12 0,2; Hill 600; Myoinositol 400; Vitamina C 200; Vitamina A 5000 UI; Vitamina E 100;
Vitamina D 0,1; Vitamina K 5.
†
Extracto libre de nitrógeno = 100 - (% proteína bruta +% extracto etéreo +% bra bruta
+% ceniza).
‡
Se calculó con los coecientes calóricos: 23,4 kJ. g
-1
, 39,2 kJ.g
-1
, 17,2 kJ.g
-1
de proteína, grasas y carbohidratos,
respectivamente (Goddard, 1996).
1
Comercial El Gordillo, Santo Domingo de los Tsáchilas, Ecuador.
2
Valencia- Avícola, Valencia, Ecuador.
3
Supermaxi,
Quevedo, Ecuador,
4
Expectrocrom, Guayaquil, Ecuador.
5
Productos Pesqueros S.A, Manta, Ecuador.
6
Suministros AZ, La
Paz, México. *mg.kg
-1
: Magnesium sulfate 5.1; Sodium chloride 2.4; Potassium chloride 2; Ferrous sulfate 1; Zinc sulfate
0,2; Cupric sulfate 0.0314; Manganous sulfate 0.1015; Cobalt sulfate 0.0191; Calcium iodate 0,0118; Chlorine chloride
0.051. **mg.kg
-1
: Thiamine 60; Rivoavin 25; Niacin 40; Vitamin B6 50; Pantothenic acid 75; Biotin 1; Folate 10;
Vitamin B12 0,2; Hill 600; Myoinositol 400; Vitamin C 200; Vitamin A 5000 UI; Vitamin E 100; Vitamin D 0,1; Vitamin K 5.
†
Nitrogen-free extract = 100 - (% crude protein +% ethereal extract +% crude fiber +% ash).
‡
It was calculated with the
caloric coefficients: 23,4 kJ.g
-1
, 39,2 kJ.g
-1
, 17,2 kJ.g
-1
of protein, fat and carbohydrates, respectively (Goddard, 1996).
1023
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Méndez-Martínez et al. ISSN 2477-9407
Condiciones de cultivo de los
peces
Los juveniles de tilapia roja
(7,53±0,50g) se obtuvieron del
Programa de Cultivo de Peces y
se trasladaron al Laboratorio de
Acuicultura de la Facultad de Ciencias
Agropecuarias (01°03´18´´S, 79°25´24´´W)
de la Universidad Técnica Estatal de
Quevedo (UTEQ), respectivamente.
Durante una semana se aclimataron y
desparasitaron (API Stress Zyme, OH,
USA). Los organismos se colocaron
aleatoriamente en 18 tanques a una
densidad de 15 peces/tanque de 90
L agua, para un total de 270 peces.
Se alimentaron con las seis dietas
experimentales, ad libitum durante
55 días.
Se realizó el control de los
parámetros físico-químicos del agua,
la temperatura se midió con un
termómetro de mercurio (0 a 50 ºC),
el oxígeno disuelto con un oxímetro
digital (55-DO, YSI Incorporated,
Yellow Springs, OH, USA), y el pH,
NH
4
, NO
2
y NO
3
con el kit colorimétrico
(Saltwater Master Test, OH, USA),
respectivamente. Todos los tanques
se sifonearon diariamente en las
mañanas antes de alimentar, para
retirar las heces y alimento sobrante
y el agua (30% aproximadamente)
que se extraía durante el sifoneo era
reemplazada.
Obtención de muestras: sangre
y tejido muscular
Al nal del periodo de cultivo se
dejaron en ayuno 14 h antes de tomar
las muestras, para ello los juveniles
se anestesiaron con una solución de
eugenol: alcohol (relación 1:3 mL en
10 L de agua), durante 2 min. Las
week they acclimatized and dewormed
(API Stress Zyme, OH, USA). The
organisms were randomly placed in
18 tanks at a density of 15 sh/90 L
water tank, for a total of 270 sh. They
were fed the six experimental diets ad
libitum for 55 days.
The control of the physical-chemical
parameters of the water was carried
out, the temperature was measured
with a mercury thermometer (0 to
50 ºC), the dissolved oxygen with
a digital oximeter (55-DO, YSI
Incorporated, Yellow Springs, OH,
USA), and the pH, NH
4
, NO
2
and NO
3
with the colorimetric kit (Saltwater
Master Test, OH, USA), respectively.
All tanks were siphoned daily in the
morning before feeding, to remove
the feces and excess food and the
water (approximately 30 %) that was
extracted during the siphoning was
replaced.
Sampling: blood and muscle
tissue
At the end of the culture period,
they were fasted for 14 h before taking
the samples, for this the juveniles were
anesthetized with a eugenol:alcohol
solution (ratio 1:3 mL in 10 L of
water), for 2 min. Blood samples were
obtained as indicated by Azizoglu
and Cengizler (1996), by caudal
venipuncture with 3 mL disposable
syringes and deposited in vacutenier
tubes (Vacuette, Laborgeräte GmbH,
Eschau, DE) and capillary tubes
(Isolab, Laborgeräte GmbH, Eschau,
DE) with heparinized inner surfaces,
and they were kept refrigerated at 4 °C
for 24 h. They were then centrifuged
(Gemmy, PLC-05, Taipei, TW) at 1200
rpm for 10 min to separate the plasma
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muestras de sangre se obtuvieron
según lo indicado por Azizoglu y
Cengizler (1996), por venopunción
caudal con jeringas desechables de 3
mL y depositada en tubos vacutenier
(Vacuette, Laborgeräte GmbH,
Eschau, DE) y tubos capilares (Isolab,
Laborgeräte GmbH, Eschau, DE) con
supercie interior heparinizados, y
se conservaron en refrigeración a 4
°C por 24 h. Luego se centrifugaron
(Gemmy, PLC-05, Taipei, TW) a 1200
rpm durante 10 min para separar el
plasma de los elementos formes. El
tejido muscular se disectó y conservó
en bolsas de plástico por separado y se
almacenaron a -40 °C hasta su análisis
químico (Azaza et al., 2009). Todos los
análisis se realizaron por triplicado.
Indicadores evaluados
Para el análisis de composición
química (materia seca, proteínas,
lípidos, carbohidratos y ceniza)
del tejido muscular y las dietas se
utilizaron los métodos descritos por
la AOAC (2019). La evaluación de
glucosa (Trinder, 1969), colesterol
y triglicéridos (Schettler y Nussel,
1975) en plasma fue con reactivos kit
(Human liquicolor, Wiesbaden, DE)
para cada variable respectivamente.
Luego se incubaron a una temperatura
de 37 °C durante 25min en baño
María. Las reacciones colorimétricas
cambiaron de acuerdo a la variable,
para colesterol y triglicéridos fueron
pruebas con factor aclarante de lípidos
y para glucosa fue a través del método
de desproteinización. Luego se llevaron
al espectrofotómetro (SunostIk, SBA-
733 Plus, Kunshan Road, CHN) para
determinar la lectura de absorbancia
a 500 ηm, respectivamente.
from the formed elements. Muscle
tissue was dissected and preserved
in separate plastic bags and stored at
-40 °C until chemical analysis (Azaza
et al., 2009). All analyzes were carried
out in triplicate.
Evaluated indicators
For the analysis of chemical
composition (dry matter, proteins,
lipids, carbohydrates and ash) of
muscle tissue and diets, the methods
described by the AOAC (2019) were
used. The evaluation of glucose
(Trinder, 1969), cholesterol and
triglycerides (Schettler and Nussel,
1975) in plasma was with kit reagents
(Human liquicolor, Wiesbaden, DE)
for each variable respectively. Then
they were incubated at a temperature
of 37 °C for 25 min in a water bath.
The colorimetric reactions changed
according to the variable, for cholesterol
and triglycerides they were tests with
lipid lightening factor and for glucose
it was through the deproteinization
method. They were then taken to the
spectrophotometer (SunostIk, SBA-
733 Plus, Kunshan Road, CHN) to
determine the absorbance reading at
500 ηm, respectively.
To determine the enzyme
superoxide dismutase, the erythrocytes
were washed 4 times with 3.0 mL of
0.9% NaCl solution, centrifuging for
10 min at 3000 rpm after each wash.
A Kit (Ransel, Randox, Crumlin,
Antrim, UK) was used, based on
the methodology of McCord and
Fridovich (1969), with a principle in
the oxidation of glutathione (GSH) by
cumene hydroperoxide catalyzed by
GPx; in the presence of glutathione
reductase (GR) and NADPH; the
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Para determinar la enzima
superóxido dismutasa se lavaron
los eritrocitos 4 veces con 3,0 mL
de solución de NaCl al 0,9 %,
centrifugando durante 10 min a 3000
rpm después de cada lavado. Se empleó
un Kit (Ransel, Randox, Crumlin,
Antrim, UK), basado en metodología
de McCord y Fridovich (1969), con
principio en la oxidación de glutatión
(GSH) por el hidroperóxido de cumeno
catalizado por la GPx; en presencia de
glutatión reductasa (GR) y NADPH;
la lectura de absorbancia se realizó a
340ηm. Se realizó el recuento total de
leucocitos en cámara de Neubauer de
0,0025 mm
2
(Optic Labor, DE) (Hrubec
y Smith, 2010).
Análisis estadísticos
A los datos se aplicaron las pruebas
de Kolmogorov - Smirnov (P<0,05)
y Bartlett (P<0,05) previamente al
análisis de varianza (ANOVA), cuando
se observó valores signicativos de F,
se utilizó la prueba de rangos múltiples
de LSD
de Fisher (P<0,05). Se aplicó
el software Minitab 18 (Minitab Inc.,
Philadelphia, PA, USA). Todos los
datos porcentuales se transformaron
por medio de log
10
para normalizar su
distribución, antes de los estadísticos.
Resultados y discusión
Los parámetros de calidad del agua
fueron los siguientes: temperatura
entre 25,0 – 26,0 °C, O
2
de 4,06 – 5,0
mg.L
-1
, pH de 7 – 8, NH
4
de 0,05 –
0,08 mg.L
-1
, NO
2
de 0,50 – 1,0 mg.L
-1
y NO
3
de 20 – 40 mg.L
-1
. Estos
valores se encuentran dentro de los
absorbance reading was made at 340
um. The total leukocyte count was
performed in a Neubauer chamber of
0.0025 mm
2
(Optic Labor, DE) (Hrubec
and Smith, 2010).
Statistical analysis
The Kolmogorov - Smirnov (P
<0.05) and Bartlett (P <0.05) tests
were applied to the data prior to the
analysis of variance (ANOVA), when
signicant values of F were observed,
the rank test was used Fisher’s LSD
multiples (P <0.05). Minitab 18
software (Minitab Inc., Philadelphia,
PA, USA) was applied. All percentage
data were transformed by means of
log
10
to normalize their distribution,
before the statistics.
Results and discussion
The water quality parameters were
the following: temperature between
25.0 - 26.0 °C, O
2
of 4.06 - 5.0 mg.L
-1
,
pH of 7 - 8, NH
4
of 0.05 - 0.08 mg.L
-
1
, NO
2
from 0.50 - 1.0 mg.L
-1
and NO
3
from 20 - 40 mg.L
-1
. These values are
within the regular limits for production
under controlled conditions of tilapia
(Azaza et al., 2009; Méndez-Martínez
et al., 2019), so it is assumed that the
variations in the results were due to
the treatments.
Muscle tissue protein showed the
highest values (75.77, 71.42 and 74.50
% protein), (p <0.05) when they were
fed diets containing chitosan levels
of 2, 4 and 5 %, respectively. In this
sense, Fadl et al. (2020), found an
increase in protein in Nile tilapia with
chitosan supplementation (5 %) in the
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límites regulares para producción
en condiciones controladas de tilapia
(Azaza et al., 2009; Méndez-Martínez
et al., 2019), por lo que se supone que
las variaciones en los resultados se
debieron a los tratamientos.
En el cuadro 2, se muestra
la composición química del
tejido muscular, la cual dirió
signicativamente (p<0,05) entre los
tratamientos para proteína, hidratos
de carbono y lípidos. Por otro lado,
para materia seca y cenizas que
resultaron similares, aunque los
valores más bajos se encontraron en el
tratamiento control.
Cuadro 2. Composición química del músculo en juveniles de tilapia roja
en base seca con suplementación de quitosano en dieta.
Table 2. Chemical composition of muscle in red tilapia juveniles on a dry
basis with dietary chitosan supplementation.
Variables (%)
Niveles de Quitosano en Dietas (%)
EE p
0 1 2 3 4 5
Materia Seca 17,79 18,82 18,84 21,26 20,01 20,86 0,730 0,078
Proteínas 55,77c 42,92d 75,77a 70,58b 71,42ab 74,50a 4,688 0,002
Lípidos 5,08ab 4,43b 6,72a 4,34b 3,51c 3,71c 1,073 0,014
Hidratos de Carbono 35,02a 47,12a 14,01b 18,83c 17,87c 17,42c 3,771 0,001
Ceniza 4,14 5,78 4,92 5,81 5,09 5,10 0,324 0,536
abcd
Letras diferentes dentro de la misma la, dieren para p<0,05. EE: Error Estándar.
a, b, c, d
Different letters within the same row, differ for p <0.05. EE: Standard Error.
La proteína del tejido muscular
mostró los valores más altos (75,77,
71,42 y 74,50 % de proteína), (p<0,05)
cuando se alimentaron con dietas que
contenían niveles de quitosano de
2, 4 y 5%, respectivamente. En este
sentido Fadl et al. (2020), encontraron
aumento de proteína en la tilapia
del Nilo con la suplementación de
diet and associated it with high serum
proteins (albumin and globulin).
Proteins, both cellular and plasma, are
part of a general deposit of products
in circulation for the maintenance
of the physiological processes of the
organism.
The highest content of
carbohydrates in muscle tissue
was found with chitosan levels of
0 and 1 %, which corresponded to
the glucose levels (table 3) that
decreased (p <0.05) to higher levels
of chitosan, which is a sensitive
indicator to physiological changes
and immune response capacity. Low
plasma glucose levels may indicate
low stress and better metabolic
efciency (Li et al., 2018). It should
be noted that it was not determined
in this work if the increase in
carbohydrates is structural or
energetic, since the method to
determine them did not allow to
establish this difference.
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quitosano (5%) en la dieta y lo asocio
con proteínas séricas altas (albumina
y globulina). Las proteínas, tanto
celulares, como plasmáticas son parte
de un depósito general de productos
en circulación para mantenimiento de
los procesos siológicos del organismo.
El mayor contenido de hidratos
de carbonos en tejido muscular se
encontraron con niveles de quitosano
de 0 y 1%, lo cual se correspondió
con los niveles de glucosa (cuadro
3) que disminuyó (p<0,05) a niveles
superiores de quitosano, la cual es
un indicador sensible a cambios
siológicos y capacidad de respuesta
inmune. Los bajos niveles de glucosa
en plasma pueden indicar bajo estrés
y mejor eciencia metabólica (Li et
al., 2018). Cabe destacar que no se
determinó en este trabajo si el aumento
de carbohidratos es estructural o
energético, ya que el método para
determinarlos no permitió establecer
esta diferencia.
La adición de diferentes
concentraciones de quitosano,
especialmente 4 y 5 %, disminuyó
(p<0,05) el contenido de lípidos en el
músculo de la tilapia (cuadro 2), y las
concentraciones séricas de colesterol
y triglicéridos (cuadro 3). En este
sentido, Miao et al. (2020), expresan
que el quitosano regula el metabolismo
de las grasas, ácidos grasos y Esto
podría atribuirse al efecto que ejerce
el biopolímero quitosano sobre la
utilización eciente de los nutrientes
estimulando el metabolismo de los
lípidos. El quitosano puede quelar los
iones metálicos o eliminar los radicales
libres mediante la donación de
hidrógeno o un par de electrones (Ngo
The addition of different
concentrations of chitosan, especially
4 and 5 %, decreased (p <0.05) the
lipid content in tilapia muscle (Table
2), and the serum concentrations of
cholesterol and triglycerides (Table
3). In this sense, Miao et al. (2020),
state that chitosan regulates the
metabolism of fats, fatty acids and
this could be attributed to the effect
exerted by the chitosan biopolymer
on the efcient use of nutrients
by stimulating lipid metabolism.
Chitosan can chelate metal ions or
scavenge free radicals by donating
hydrogen or an electron pair (Ngo
and Kim, 2014), where an increase
in superoxide dismutase activity may
be as a consequence of a response
to changes in the lipid composition
of leukocyte cell membranes, which
interfere with the production of
cell activating factors (cytokines or
chaperonins) that improve or decrease
phagocytic capacity (Biller and
Takahashi, 2018).
The activity of the enzyme
superoxide dismutase (gure 1) was
inuenced (p <0.05) by the levels of
chitosan 3 and 4 % in the diet, reaching
values of 187.16 and 181.56 U.mL
-1
of
blood, respectively. Soberanes-Yepiz
et al. (2018), suggest that higher
antioxidant values are a consequence
of multiple oxidative reactions,
therefore, this could indicate that it
is the site of the highest production of
free radicals. Kim and Thomas (2007),
found that diets supplemented with
chitosan for Atlantic salmon (Salmo
salar) showed antioxidant activities
and a reduction in lipid oxidation in
terms of prevention of oxidative stress.
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y Kim, 2014), donde un aumento de
la actividad de superóxido dismutasa
puede ser como consecuencia de una
respuesta a cambios en la composición
lipídica de las membranas celulares
de los leucocitos, que intereren con la
producción de factores activadores de
células (citocinas o chaperoninas) que
mejoran o disminuyen la capacidad
fagocítica (Biller y Takahashi, 2018).
La actividad de la enzima
superóxido dismutasa (gura 1) se vio
inuenciada (p<0,05) por los niveles
de quitosano 3 y 4 % en la dieta
alcanzando valores de 187,16 y 181,56
U.mL
-1
de sangre, respectivamente.
Soberanes-Yepiz et al. (2018), sugieren
que mayores valores de antioxidantes
son consecuencia de múltiples
reacciones oxidativas, por tanto, esto
pudiera indicar ser el sitio de mayor
producción de radicales libres. Kim y
Thomas (2007), encontraron que las
dietas suplementadas con quitosano
para el salmón Atlántico (Salmo salar)
mostraron actividades antioxidantes
The mechanism of action of the
immunostimulating effect of chitosan
within the body of the sh is not yet
fully understood. Non-specic cellular
immunity is known to comprise three
defensive mechanisms: inammation,
phagocytosis, and non-specic
cytotoxicity. It was observed that
inammation involves leukocytes
and follows exposure to an antigenic
challenge, after contact with the
antigen, the affected area receives
greater blood supply, followed by an
increase in capillary permeability
and migration of leukocytes from
the blood into the tissue (Szwejser
et al., 2017), and although they only
constitute about 1 % in the blood,
they are involved in various allergic
reactions and contribute to the repair
of damaged tissue, as well as the
elimination of tumor cells (Nakanishi
et al., 2015).
A signicant leukocyte response
(gure 2) was observed in sh
fed chitosan in a dose-dependent
Cuadro 3. Bioquímica plasmática en juveniles de tilapia roja con
suplementación de quitosano en dieta.
Table 3. Plasma biochemistry in juvenile red tilapia with dietary
chitosan supplementation.
Variables (mg.dL
-1
)
Niveles de Quitosano en Dietas (%)
EE p
0 1 2 3 4 5
Glucosa 57,33a 53,67a 58,33a 39,67b 36,33b 43,67b 2.591 0,014
Colesterol 140,67b 163,00a 156,67ab 110,33c 130,00c 134,33bc 8.221 0,019
Triglicéridos 159,67ab 199,67a 123,67b 72,33c 103,00c 91,00c 10.326 0,000
a, b, c, d
Letras diferentes dentro de la misma la, dieren para p <0.05. EE: Error Estándar.
a, b, c, d
Different letters within the same row, differ for p <0.05. EE: Standard Error.
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y una reducción de la oxidación de
lípidos en términos de prevención del
estrés oxidativo.
Figura 1. Actividad de superóxido dismutasa (p=0,0041), en tilapia roja
con suplementación de quitosano en dieta.
Figure 1. Superoxide dismutase activity (p = 0.0041), in red tilapia with
dietary chitosan supplementation.
El mecanismo de acción del efecto
de inmunoestimulación del quitosano
dentro del cuerpo del pez aún no
se comprende completamente. Se
conoce que la inmunidad celular no
especíca comprende tres mecanismos
defensivos: la inamación, la fagocitosis
y la citotoxicidad no especíca. Se
observó que la inamación involucra a
los leucocitos y sigue a la exposición a
un desafío antigénico, posteriormente
al contacto con el antígeno, el área
afectada recibe mayor irrigación
sanguínea, seguida de un aumento en
manner, which may be related
to hematopoiesis involving the
production of leukocyte cells mainly
in the head kidney in the case of
teleost sh (Press and Evensen, 1999;
Zapata et al., 1996). Hematopoietic
stem cells are located in this organ,
which is why they have an extensive
network to trap particles carried in
the blood (Hanington et al., 2009),
given that larger populations of
macrophages and lymphocytes are
located in the kidney and spleen
capable of initiating an immune
response (Press and Evensen, 1999).
This suggests that the level of
chitosan in the diet was able to
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la permeabilidad capilar y la migración
de los leucocitos de la sangre hacia el
tejido (Szwejser et al., 2017), y aunque
solo constituyen alrededor del 1 % en
la sangre, están implicados en diversas
reacciones alérgicas y contribuyen a la
reparación del tejido dañado, así como
a la eliminación de células tumorales
(Nakanishi et al., 2015).
Se observó una respuesta
signicativa de leucocitos (gura 2)
en peces alimentados con quitosano
de manera dependiente de la dosis,
lo cual se puede relacionar con
la hematopoyesis que implica la
producción de células leucocitarias
principalmente en el riñón cefálico
en el caso los peces teleósteos (Press
y Evensen, 1999; Zapata et al., 1996).
En este órgano se localizan las células
madre hematopoyéticas, por lo que
tienen una extensa retícula para
atrapar partículas acarreadas en la
sangre (Hanington et al., 2009), dado
a que en el riñón y el bazo se localizan
mayores poblaciones de macrófagos
y linfocitos capaces de iniciar una
respuesta inmune (Press y Evensen,
1999).
Esto sugiere que el nivel de
quitosano en dieta pudo estimular el
microambiente donde se desarrollan
las células hematopoyéticas y
factores y proteínas de crecimiento
intracelulares. En este sentido, se
reportó que la proteína alfa de unión
al potenciador CCAAT (C/EBPα),
es requerida para el desarrollo de
granulocitos, pero también promueve
la diferenciación de células madres
hematopoyéticas, sin embargo,
cuando es deciente C/EBPα, se
bloquea la diferenciación hacia el
stimulate the microenvironment where
hematopoietic cells and intracellular
growth factors and proteins develop.
In this sense, it was reported that the
alpha protein binding to the enhancer
CCAAT (C/EBPα) is required for the
development of granulocytes, but it
also promotes the differentiation of
hematopoietic stem cells, however,
when C/EBPα is decient, it is blocks
differentiation towards the myeloid
lineage (Zhang et al., 2004). Dietary
supplementation with chitosan
stimulated immunological parameters
by increasing antioxidant activity and
leukocyte content.
Conclusion
The biochemical and immune
response in juvenile red tilapia
(Oreochromis mossambicus
× O.
niloticus) was favored with dietary
chitosan supplementation.
Acnowledgment
The research was supported by
the Universidad Técnica Estatal
de Quevedo and the Projects:
FOCYCYT-7ma/PFOC7-48-2020 and
EMBLEMÁTICOS/PEMBL-003-2018.
Our gratitude for the technical
assistance to Ing. Lourdes Ramos,
Ing. Tania Leones, and Lic. Wendy
Hidalgo.
End of English Version
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Figura 2. Contenido de Leucocitos (p=0,010), en tilapia roja con
suplementación de quitosano en dieta.
Figure 2. Leukocyte content (p=0.010), in red tilapia with dietary chitosan
supplementation.
linaje mieloide (Zhang et al., 2004).
La suplementación dietética con
quitosano estimuló parámetros
inmunológicos al incrementar la
actividad antioxidante y contenido
de leucocitos.
Conclusión
La respuesta bioquímica e
inmune en juveniles de tilapia
roja (Oreochromis mossambicus
× O. niloticus) se favoreció con
suplementación de quitosano en dieta.
Agradecimientos
La investigación estuvo
respaldada por la Universidad
Técnica Estatal de Quevedo y los
Proyectos: FOCYCYT-7ma/PFOC7-
48-2020 y EMBLEMÁTICOS/
PEMBL-003-2018. Nuestro
agradecimiento por la asistencia
técnica a Ing. Lourdes Ramos,
Ing. Tania Leones, y Lic. Wendy
Hidalgo.
Literatura citada
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2019. Effects of dietary chitosan
supplementation on farmed sh; a
review. Rev. Aquacult. 12(1): 438-
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Supplementation of diets for
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