970
Rev. Fac. Agron. (LUZ). 2021, 38(4): 970-992. Octubre-Diciembre.
DOI: https://doi.org/10.47280/RevFacAgron(LUZ).v38.n4.13 ISSN 2477-9407
Esta publicación científica en formato digital es continuación de la Revista Impresa: Depósito legal pp 196802ZU42, ISSN 0378-7818.
Recibido: 14-03-2021 . Aceptado: 28-06-2021.
*Autor de correspondencia. Correo electrónico: lgonzalezpaz@gmail.com
Caracterización del complejo genético
tracrARN-
DR
ARN asociado al sistema CRISPR-Cas9
del fitosimbionte Acholeplasma palmae descriptor:
interés biotecnológico
Characterization of the tracrARN-
DR
ARN genetic
complex associated with the CRISPR-Cas9 system of the
phytosymbiont Acholeplasma palmae: biotechnological
interest
Caracterização do complexo genético tracrARN-
DR
ARN
associado ao sistema CRISPR-Cas9 do descritor
de Acholeplasma palmae tossimbionte: interesse
biotecnológico
Luis Moncayo
1
, Alex Castro
2
, Diego Arcos
2
, Paulo
Centanaro
2
, Diego Vaca
3
, Cristina Maldonado
4
, Aleivi Perez
6
,
Carla Lossada
7
, Lenin González-Paz
5,8
*
1
Universidad Católica de Cuenca, Ecuador. Correo electrónico: luismoncayo834@hotmail.
com, .
2
Universidad Agraria de Ecuador, Facultad de Ciencias Agrarias, Ecuador.
Correo electrónico: (AC): alcastro2010@hotmail.es, ; (DA): arcosda@hotmail.com,
(PC): pcentanaro@uagraria.edu.ec, .
3
Universidad Laica Eloy Alfaro de Manabí,
Ecuador. Correo electrónico: diegoalf13@gmail.com; .
4
Laboratorio de Biotecnología,
Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad Técnica de Babahoyo, Ecuador.
Correo electrónico: cmaldonadoc@yahoo.com .
5
Laboratorio de Genética y Biología
Molecular, FEC-LUZ. Zulia, Maracaibo, Venezuela. Correo electrónico: lgonzalezpaz@
lgonzalezpaz@gmail.com, .
6
Laboratorio de Microbiología General, FEC-LUZ. Zulia,
Maracaibo, Venezuela. Correo electrónico: aleiviciencias@gmail.com, .
7
Laboratorio
de Caracterización Molecular y Biomolecular, Centro de Investigación y Tecnología de
Materiales, Instituto Venezolano de Investigaciones Cientícas (IVIC), Zulia, Venezuela.
526. Correo electrónico: lossadacarla@gmail.com, .
8
Doctorado en Ciencias Agrarias,
Facultad de Agronomía, Universidad del Zulia, Zulia, Venezuela.
971
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Moncayo et al. ISSN 2477-9407
Resumen
La tecnología CRISPR-Cas9 usada en biotecnología vegetal se fundamenta
en el empleo de nucleasas Cas9 para generar cortes precisos en el genoma y un
dúplex conformado por un trans-activador CRISPR ARN (tracrARN) y un CRISPR
ARN (
DR
ARN) los cuales son precursores del ARN guía (sgARN) rediseñado
comercialmente (sgARN-Cas9) para guiar la escisión de genes. La mayoría
de estas herramientas provienen de bacterias clínicas. Sin embargo, existen
diversos sistemas CRISPR-Cas9 en microorganismos ambientales como los
toendosimbiontes del género Acholeplasma. Pero la explotación de estos sistemas
más compatibles con plantas requiere usar herramientas bioinformáticas para su
predicción y estudio. Fueron identicados y caracterizados los elementos asociados
al dúplex tracrARN-
DR
ARN en A. palmae. Para ello la información proteica se
obtuvo del Protein Data Bank y la genómica del GenBank/NCBI. El sistema
CRISPR fue estudiado con el software CRISPRnder. Se utilizaron algoritmos
de alineamiento y el software NUPACK para identicar los módulos tracrARN
y
DR
ARN, y también diversos softwares computacionales para la caracterización
genética, estructural y biofísica. Se encontró un sistema CRISPR-Cas en A.
palmae con características de tipo II-C, así como un dúplex con regiones exibles,
termodinámicamente muy estable, presentando una energía de acoplamiento
con Cas9 termodinámicamente favorecida. Estos resultados son deseables en
sistemas de edición programable de genes y evidencian la posibilidad de explorar
herramientas moleculares nativas en microorganismos ambientales aplicables a
la manipulación genética de plantas, conforme se realicen más investigaciones.
Este estudio representa el primer reporte sobre la estabilidad termodinámica y el
acopamiento molecular de elementos asociados al dúplex tracrARN-
DR
ARN en el
tosimbionte A. palmae.
Palabras clave: acoplamiento molecular, bioinformática, mycoplasma,
transactivador.
Abstract
The CRISPR-Cas9 technology used in plant biotechnology is based on the
use of Cas9 endonucleases to generate precise cuts in the genome, and a duplex
consisting of a trans-activating CRISPR RNA (tracrRNA) and a CRISPR RNA
(
DR
RNA) which are precursors of guide RNA (sgRNA) commercially redesigned
(sgRNA-Cas9) to guide gene cleavage. Most of these tools come from clinical
bacteria. However, there are several CRISPR-Cas9 systems in environmental
microorganisms such as phytoendosymbionts of plants of the genus Acholeplasma.
But the exploitation of these systems more compatible with plants requires using
bioinformatics tools for prediction and study. We identied and characterized the
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elements associated with the duplex in the genome of A. palmae. For this, the
protein information was obtained from the Protein Data Bank and the genomics
from GenBank/NCBI. The CRISPR system was studied with the CRISPRnder
software. Alignment algorithms and NUPACK software were used to identify the
tracrRNA and
DR
RNA modules, together with various computational software for
genetic, structural and biophysical characterization. A CRISPR-Cas system was
found in A. palmae with type II-C characteristics, as well as a thermodynamically
very stable duplex, with exible regions, exhibiting a docking power with Cas9
thermodynamically favored. These results are desirable in programmable gene
editing systems and show the possibility of exploring native molecular tools in
environmental microorganisms applicable to the genetic manipulation of plants,
as more research is carried out. This study represents the rst report on the
thermodynamic stability and molecular docking of elements associated with the
tracrRNA-
DR
RNA duplex in the phytosymbiont A. palmae.
Keywords: molecular docking, bioinformatics, mycoplasma, transactivator.
Resumo
A tecnologia CRISPR-Cas9 usada em biotecnologia vegetal é baseada no uso
de nucleases Cas9 para gerar cortes precisos no genoma e um duplex composto de
um RNA CRISPR transativador (tracrRNA) e um RNA CRISPR (
DR
ARN) que são
precursores de o RNA guia comercialmente reprojetado (sgRNA) (sgRNA-Cas9) para
guiar a clivagem do gene. A maioria dessas ferramentas vem de bactérias clínicas. No
entanto, existem vários sistemas CRISPR-Cas9 em microrganismos ambientais, como
toendossimbiontes do gênero Acholeplasma. Mas a exploração desses sistemas mais
compatíveis com as plantas requer o uso de ferramentas de bioinformática para sua
previsão e estudo. Os elementos associados ao duplex tracrARN-
DR
ARN em A. palmae
foram identicados e caracterizados. Para isso, as informações sobre proteínas foram
obtidas no Protein Data Bank e a genômica no GenBank / NCBI. O sistema CRISPR
foi estudado com o software CRISPRnder. Algoritmos de alinhamento e o software
NUPACK foram utilizados para identicar os módulos tracrRNA e
DR
ARN, além de
diversos softwares computacionais para caracterização genética, estrutural e biofísica.
Um sistema CRISPR-Cas foi encontrado em A. palmae com características do tipo II-
C, bem como um duplex com regiões exíveis, termodinamicamente muito estável,
apresentando uma energia de acoplamento termodinamicamente favorecida com
Cas9. Esses resultados são desejáveis em sistemas de edição de genes programáveis
e mostram a possibilidade de explorar ferramentas moleculares nativas em
microrganismos ambientais aplicáveis à manipulação genética de plantas, à medida
que mais pesquisas são realizadas. Este estudo representa o primeiro relatório sobre
a estabilidade termodinâmica e acoplamento molecular de elementos associados ao
duplex tracrRNA-
DR
ARN no tossimbionte A. palmae.
Palavras chave: acoplamento molecular, bioinformática, micoplasma, transativador
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Introducción
Acholeplasma es un género de
bacterias tosimbiontes sin pared
celular, clasicadas en la división
Firmicutes, clase Mollicutes,
orden Acholeplasmatales y familia
Acholeplasmataceae. Hay 15 especies
reconocidas en este género. Los
genomas de las especies varían de 0,5
a 2,2 Mbp con un contenido de G+C es
bajo, oscilando entre 20% y 40%. La
temperatura óptima de crecimiento
de estos organismos es de 30º a 37º C,
son saprótas y se encuentran en el
suelo, el compost, las aguas residuales
o como comensales de vertebrados,
insectos o plantas, siendo consideras
como endosimbiontes de plantas
(Ipoutcha et al., 2019).
Hasta ahora no hay información
sobre si alguna de las especies de
Acholeplasma sea patógeno primario
de plantas, pero se sabe que pueden
causar efectos citopáticos en cultivos
de tejidos (Windsor et al., 2010; Kube
et al., 2014). Estas bacterias pueden
aislarse de la supercie de plantas
como el brócoli (Brassica oleracea
var. italica descriptor) o de tejidos de
la corona de la palma de coco (Cocos
nucifera descriptor) (Tully et al.,
1994).
A. aidlawii ha sido la especie
más estudiada y la única del
género aprovechada en estudios
biotecnológicos (Windsor et al., 2010;
Wu et al., 2018; Mirabelli et al., 2019).
Sin embargo, existen otras especies del
género Acholeplasma cuyos genomas
han sido completamente secuenciados
como A. palmae J233 (cuyo genoma es
de 1.554.229 bp), y esto ha permitido el
Introduction
Plant’s health and productivity
have been linked to their microbiota
dominated mainly by bacteria
and fungi (Purahong et al., 2018).
Interactions between plants and
microorganism have been present
for a long time in evolution, since
microorganisms have helped plants to
deal with lack of nutrients, stressful
conditions, and pathogens (Smith et al.,
2015). The study of plant-associated
bacteria, their antagonistic potential
in control of pathogens and their effect
as growth promoters comprise the
action of several genera and species of
bacteria that can be isolated from the
surface of plant tissues or obtained
from within the plant (Daungfu et
al., 2019). In Mexico, and many other
parts of the world, basil (Ocimum
basilicum L., Fam. Lamiaceae) is
an economically important aromatic
herb. In Baja California Sur, Mexico,
production of sweet basil was
approximately 1,685 tons at the end
of 2019 cycle (SIAP 2019). Nuffar
variety was the main sweet basil
grown in the state. This plant is used
in the food industry and in traditional
medicine (Gilardi et al., 2013). Basil
plants shelter a distinctive microbiota
responsible for growth, quality and
health via microbial metabolism
and host interactions (Adamović
et al., 2015). However, successive
cultivation in the same soil for a
long time is known to be associated
with changes in physicochemical
properties of the ground, which in
turn, provides conditions that cause
diseases by pathogens, leading to
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estudio comparativo entre las especies
del género y las especies relacionadas
(Tully et al., 1994; Kube et al., 2014).
Es importante destacar que los
análisis comparativos han revelado
que A. palmae J233 es la única especie
descrita de estos toendosimbiontes
con un sistema genético tipo CRISPR-
Cas (Clustered Regularly Interspaced
Short Palindromic Repeats and
CRISPR-associated systems or cas
genes) conrmado, pero aun no
caracterizado (Bumgardner et al.,
2015). Estos sistemas genéticos son
importantes porque pueden estar
asociados a factores de patogenicidad y
virulencia en microrganismos (Westra
et al., 2014). También son precursores
de herramientas de manipulación
genética usadas en biotecnología
vegetal como estrategia hacía una
agricultura sostenible (Belhaj et al.,
2015).
Especícamente, los sistemas
CRISPR son un nuevo grupo
de herramientas empleadas en
biotecnología vegetal basada en el uso
de endonucleasas de restricción de la
familia caspasas, como la Cas9, que
provienen del sistema de inmunidad
natural procariota CRISPR tipo II, y
que incluye la nucleasa, la secuencia
trans-activadora CRISPR RNA
(trans-activating CRISPR RNA o
tracrRNA), la secuencia CRISPR
ARN (CRISPR RNA o crRNA) y el
motivo adyacente al protoespaciador
(protospacer adjacent motifs o
PAM). El crARN, tracrARN y PAM
conforman los elementos genéticos
del complejo tracrARN-crARN, el
cual es precursor del ARN de guía
única (sgARN) (simple guide RNAs
devastating yield losses. In this
study, the objective was to isolate and
identify bacteria associated to healthy
basil plants from crops around La
Paz, Baja California Sur, Mexico,
with the ability to inhibit pathogenic
fungi development without affecting
seedling development.
Material and methods
Plant material and
experimental site
Samples of basil plants were
taken from crops with similar
agroecological conditions within the
area of La Paz, B.C.S. México. Three
adult basil plants, ready for harvest,
apparently healthy, with intact aerial
parts (normal leaves without spots
or color alterations), stems without
deformations, separated at least 50
meters one from each other, were
randomly selected per crop. The crop
locations were: Pescadero (Pradera
Escolar 23°21´56”N, 110°10´27”W
and Las Maravillas 23°21´43”N,
110°11´18”W), Todos Santos (Sueño
Tropical 23°31´29”N, 110°17´15”W)
and Los Planes (Cesar Cárdenas,
23°57´11”N, 109°55´50”W). Root,
stem and leaves of each plant were
separated and placed in sterile
plastic bags. Later, the samples were
transported to the Laboratory where
the microbiological analysis was
carried out.
Isolation of bacteria
To isolate predominant bacteria,
two culture media were used.
Standard methods agar or plate
count agar (SMA, DIFCO) was used
to isolate bacteria and de Man Rogosa
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o sgRNA), una molécula rediseñada
comercialmente para establecer un
complejo ribonucleoproteico (RNP)
con el sgARN y la nucleasa (formado
en complejo sgARN-Cas9) y dirigir de
forma especíca la escisión (o corte)
programable de genes y genomas
(Chyou y Brown, 2019). Por lo tanto,
caracterizar los elementos tracrARN
y crARN tienen un alto interés
biotecnológico (Kaushik et al., 2019).
En este sentido esta investigación
se centró en dicha caracterización.
Especialmente porque se sabe que
el uso de sistemas compatibles
con el objeto de estudio como las
“agrobacterias” para plantas, puede
otorgar mejoras en los procesos de
edición genética y tomejoramiento
de las células vegetales receptoras
(Demirer et al., 2019; Danilo et al.,
2019; Zhang et al., 2020; Rodríguez et
al., 2021). El interés también radica
en que existe una gran diversidad de
herramientas para la manipulación
genética de plantas, pero todas
provienen de sistemas CRISPR tipo-
II de bacterias de interés clínico como
Staphylococcus aureus (SaCas9),
Streptococcus thermophilus (StCas9),
Neisseria meningitides (NmCas9)
y Streptococcus pyogenes (SpCas9)
(Zhang et al., 2019).
Sin embargo, en la naturaleza
existe una gran diversidad de sistemas
CRISPR-Cas tipo II y de elementos
claves para la edición genética como
los complejos tracrARN-crARN en
microorganismos ambientales menos
estudiados como A. palmae, la única
especie del género Acholeplasma
con un sistema CRISPR conocido
(Bumgardner et al., 2015). Pero la
and Sharp agar (MRS, DIFCO) was
used to isolate lactic acid bacteria.
Briey, 10 g of root, stem or leaves
were placed into 90 mL of phosphate
buffer saline (PBS)
(145 mM NaCl,
2.87 mM KH
2
PO
4
and 6.95 mM
K
2
HPO
4
, pH 7.2) and triturated with a
tissue homogenizer (Ultra-Turrax T25,
Janke & Kunkel) until a suspension
was obtained. Serial dilutions were
prepared and then 100 µL of each
dilution was spread on duplicated
Petri dishes containing: SMA and
MRS, the plates were incubated at 35
°C for 24 h. Bacteria from predominant
and morphologically different colonies
were cross streaked and puried onto
plates containing the same media as
the plate they grew rst. Bacteria
were characterized by Gram staining
and cell morphology under a phase
contrast microscope (Nikon Eclipse
E-600), then inoculated in Tryptic Soy
Broth (TSB, DIFCO) and incubated
overnight at the above temperature
and preserved with 50 % glycerol at
-80 ºC (Goldman and Green 2009).
The isolated bacteria were labeled as
follows: rst two letters correspond
to the investigated plant, in this case
AL for basil; third letter corresponds
to culture media they were isolated
from, A for standard methods agar
and M for de Man Rogosa and Sharpe
medium. Fourth letter corresponds to
the part of the plant sampled: R for
root, T for stem and H for leaves. First
number corresponds to the sampling
area: 1-3 corresponds to Pescadero,
4-6 corresponds to Los Planes and 7-9
corresponds to Todos Santos. Finally,
the last number corresponds to the
isolated colony.
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explotación de estos sistemas capaces
de establecer interacciones con
plantas requiere usar herramientas
bioinformáticas para su predicción y
estudio.
Para evitar confusiones el término
tracrARN-crARN el cual se usa para
referirse típicamente al complejo
entre las secuencias llamadas
repeticiones directas (Direct Repeat o
DR) tracrARN y crARN, fue sustituido
en este trabajo por tracrARN-
DR
ARN,
debido a que en un sentido estricto el
crARN maduro se compone de la DR y
de un elemento de ARN denominado
“espaciador”, el cual no fue considerado
en los análisis realizados, por ser el
elemento genético altamente variable
del dúplex tracrARN-crARN (Chyou
y Brown, 2019). Por lo que se realizó
la caracterización de los elementos
genéticos que conforman el dúplex
designado como tracrARN-
DR
ARN
asociados al sistema CRISPR-Cas
tipo II en el genoma de A. palmae con
el interés de ofrecer bases teóricas
alternativas que contribuyan con los
procesos de manipulación genética
aplicables a la biotecnología vegetal.
Materiales y métodos
Secuencia genómica,
identificación y caracterización
del sistema CRISPR-Cas
La información genómica de la
especie A. palmae J233 (GenBank
accession GCA_000968055.1; RefSeq
accession GCF_000968055.1; RefSeq
sequence NC_022538.1) fue obtenida
del NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.
gov/). El CRISPR loci así como los
genes Cas asociados se identicaron
Model Fungi used in
antagonistic assay
The fungi used in this study were
Aspergillus spp., Alternaria spp.
and Hendersonula spp. currently
identied as Neoscytalidium
dimidiatum. Aspergillus spp. comes
from a monosporic culture isolated
from soil and characterized by its
colonial (macroscopic) and cellular
(microscopic) morphology according
to general taxonomic keys in the
Laboratorio de Ciencia y Tecnología
de Alimentos at this University. This
fungus was used in this research as a
model to carry out the rst screening
of bacteria with antagonistic capacity.
Alternaria spp. and N. dimidiatum
also come from a monosporic culture
and were previously isolated from
Ocimum basilicum L. and Ficus
benjamina respectively (Hernández-
Montiel et al., 2018). These fungi were
used as a model for important plant
pathogens in this region.
Qualitative antifungal assay
The antifungal activity was
detected using a methodology
developed by our research group.
The confrontation assays against
Aspergillus spp. were carried out in
a method previously described (Joo et
al., 2015), modied with dual culture
plates containing a mixture of TSA
and PDA at 1:1 ratio. The isolated and
puried bacteria were inoculated at
1 % in TSB and incubated overnight
at 30 ºC, then 10 µL drop of the
suspension was placed on each Petri
dish at 15 mm away from the edge.
The dishes were incubated for 24 h at
30 ºC. Subsequently, a 4 mm diameter
lter paper disk, moistened with PBS
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y caracterizaron con el servidor
web CRISPRCasFinder (Couvin et
al., 2018) (https://crisprcas.i2bc.
paris-saclay.fr/CrisprCasFinder/
Index). Todos los espaciadores fueron
comparados con la base de datos
GenBank/NCBI (Benson et al., 2018)
para la búsqueda de secuencias
homólogas con emparejamiento ≥ 95%
usando BLAST (Shen et al., 2017).
Adicionalmente se predijo el número
de posibles estructuras secundarias a
partir de las secuencias de repeticiones
directas (DR) y del tracrARN previas a
la energía libre mínima de Gibbs para
la formación (∆G) usando barriers web
server (http://rna.tbi.univie.ac.at//cgi-
bin/RNAWebSuite/barriers.cgi).
Predicción del tracrARN y
crARN
Para buscar la porción anti-
re
petición del tracrARN, se realizó
una alineación local de nucleótidos
usando BLAST entre la secuencia
DR consenso y las secuencias de
ADN dentro de una de las siguientes
cuatro regiones no codicantes:
dentro de 500 nt aguas arriba de
cas9 y entre cas9 y cas1, y en la
matriz de espaciadores más DR, o
dentro de 500 nt aguas abajo de la
matriz espaciadores más DR. Se
utilizaron los siguientes parámetros
para el BLAST: algoritmo, secuencias
algo similares (blastn); tamaño de
palabra, 7; puntajes de coincidencia/
desajuste, 1, –2; costos de brecha,
existencia 1 y extensión 2. A partir
de los resultados de la alineación,
se identicaron las secuencias del
“potencial de tracrARN”. Una vez
localizada la región anti-repetición
correspondiente al tracrARN, se
was impregnated with spores of an
Aspergillus spp. colony grown for 72
h at 30 ºC in PDA medium, and then
placed 15 mm away from the bacteria
colony. The dual cultures, performed
in duplicate, were incubated for 72
h at 30 ºC and then inhibition zones
were observed. A Petri dish inoculated
only with the disc containing the
fungus was used as positive control.
Confirmatory antifungal assay
The growth of bacteria that
clearly showed an inhibition zone of
Aspergillus spp. were tested against
Aspergillus spp., N. dimidiatum and
Alternaria spp. using methodology
developed by our research group.
Bacterial strains reactivated in TSB
were inoculated at 1 % in tubes with
the same medium and incubated for
24 h at 30 ºC. Subsequently, they
were centrifuged at 3,500 rpm, the
supernatant was decanted, and the
pellets were resuspended in the
same volume of PBS. Parallelly, the
fungi were cultivated in PDA for 72
h, its spores were collected, and its
concentration was adjusted to 10
6
spores mL
-1
by direct count, under
the microscope using a Neubauer
plate. Then, 0.1 mL of the suspensions
were spread onto TSA-PDA 1:1 Petri
dishes. Later three 10 μL drops of
each bacterial suspension were evenly
distributed on the plate previously
spread with a fungus. The plates
were then incubated at 30 ºC for 72
h. After the incubation time, the
zone of inhibition was measured in
millimeters. Two replicates were made
per treatment and the experiment
was repeated twice. Inhibition zones
were measured and bacteria with
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extendió la búsqueda en la dirección 3’
hasta que se encontró una secuencia
con semejanza a un terminador
de transcripción independiente de
Rho. Si no hubiese un terminador
transcripcional claro, se extendería la
búsqueda de tracrARN en la dirección
5’, buscando una estructura similar
anqueada por una cadena rica en
A. Los promotores transcripcionales
y los terminadores independientes
de Rho también se predijo utilizando
el programa BDGP Neural Network
Promoter Prediction (www.fruity.
org/seq_tools/promoter.html) y el
software TransTermHP (http://
transterm.ccb.jhu.edu/query.
php), respectivamente (Chylinski
et al., 2013). Si el tracrARN está
codicado en la dirección de 3’ a
5’, el complemento inverso de la
secuencia se usó durante los análisis.
Empleando el software de predicción
de plegamiento de RNA NUPACK
(http://www.nupack.org/) se predijo
las estructuras secundarias del
dúplex tracrARN y
DR
ARN, así como la
∆G. Se utilizó un algoritmo de plegado
que permite oscilaciones de base G-U.
Para NUPACK, las secuencias de
tracrARN y
DR
ARN se introdujeron
en la dirección 5’ a 3’. Usando las
siguientes opciones: tipo de ácido
nucleico, ARN; número de especies de
hebras, 2; tamaño complejo máximo,
2; concentración de cadena1, 1 μM y
concentración de cadena2, 1 μM. Se
identicaron los elementos asociados
a las estructuras secundarias (tallo
superior, bulto, tallo inferior, nexo
y horquillas) (Chylinski et al., 2013;
Briner et al., 2016; Chyou y Brown,
2019).
large inhibition zones (more than
10 mm) were selected for molecular
identication.
Molecular identification
Bacteria were identied by 16S
rDNA gene sequencing. Total DNA was
extracted following manufacturers
recommendation (Wizard® Genomic
DNA Purication Kit, Promega
Corporation). PCR was carried out
using universal primers pA (forward):
5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’
and pH (reverse):
5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’
following Broda et al. (1999) method.
The amplicons were puried and then
sequenced. The obtained data was
processed using BLAST searches in
the NCBI and uploaded to GenBank
database.
Germination test
Microtubes were lled with one
hundred twenty basil seeds. The
seeds were disinfected with a 4.25 %
aqueous sodium hypochlorite solution
for 2 minutes, rinsed with sterile
distilled water three times. Then seeds
were inoculated with the suspension
of bacteria that presented antifungal
activity against Aspergillus spp.
containing 10
6
CFU.mL
-1
and let stand
for two minutes. The supernatant was
decanted, and the seeds were set in
a completely random design which
consisted of four replicates of 30 seeds
per treatment and controls. The seeds
were placed in Petri dishes with a
lter paper covering the bottom of the
plate. Water was added to moisten the
seeds and then let stand for 5 days in
the dark in a germination chamber at
25 °C. Testa rupture was considered
as indication of germination. Five
979
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Análisis complementarios
Se determinó la longitud de las
regiones del dúplex, así como el
porcentaje GC, la temperatura de
fusión (Tm), masa molecular y regiones
de máxima exibilidad usando el
software Unipro UGENE-v.1.32.0. Se
calculó el tamaño (en términos del
radio) del dúplex tracrARN-
DR
ARN
con el método del cálculo del área de
supercie accesible al solvente (SASA)
usando el algoritmo Shrake-Rupley
(Dupuis et al., 2014). Se predijo la
estabilidad termodinámica del dúplex
en términos de ∆G usando NUPACK,
así como las estructuras secundarias
a diversos intervalos de temperatura
(12º, 15º, 23º, 30º, 37º, 40º y 42º C)
(Høyland-Kroghsbo et al., 2018).
En todos los casos fue estimado el
tamaño de las estructuras generadas.
Adicionalmente, se calculó la energía
de interacción entre las regiones del
dúplex y la nucleasa asociada mediante
acoplamiento molecular. Para ello la
información proteica se obtuvo del
Protein Data Bank (https://www.rcsb.
org/). La estructura tridimensional de
la nucleasa fue modelada con SWISS-
MODEL (https://swissmodel.expasy.
org/). El complejo tracrARN-
DR
ARN-
Cas9 se preparó con el software
HDOCK (http://hdock.phys.hust.edu.
cn/) y fue posteriormente analizado
usando Molegro Molecular Virtual
(MMV)-v.7.0.0. Se calcularon las
funciones de puntuación HDOCK
(Yan et al., 2017) y MolDock Score
(Thomsen y Christensen, 2006). Los
acoplamientos moleculares se llevaron
a cabo entre la Cas9 y cada una de
las regiones que componen al dúplex
tracrARN-
DR
ARN porque se sabe que
days old seedlings were separated
out by hypocotyl and radicle, length
of all seedlings was measured by
the software RootNav (Pound et al.,
2013), then dried and weighted to
obtain dry biomass. The signicance
of the obtained results was analyzed
by one-way univariate analysis of
variance (ANOVA), seed inoculation
with different bacteria was used as a
xed factor. The difference between
the means was determined by Tukey´s
test HSD multiple range test at p=
0.05. Mean values were considered
signicantly different when p≤ 0.05.
Statistical analysis was carried
out using SAS software (Statistical
Analysis System (SAS) software, SAS
University Edition).
Results and discussion
The microbiological status
of healthy basil plants should
be determined by the growing
conditions, the environment of the
region, the method of cultivation and
the associated benecial microbiota
at any stage of their production
process. In this study a total of 165
isolates were obtained from the
predominant microbiota of different
parts of the sampled apparently
healthy basil plants from different
sites. Ninety-four isolates were from
SMA and 71 from MRS media used
in the microbiological analysis, all
of them were Gram positive, 152
with bacillary and 13 with coccoid
morphology. Among the most
common plant colonizing bacteria,
we can nd those of the Bacillus
genus (Moffat, 2001). It is known
980
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en la naturaleza la Cas9 interacciona
tanto con el complejo (tracrARN-
DR
ARN) como con cada uno de sus
elementos de manera independiente
(Jinek et al., 2012).
Resultados y discusión
Organización del sistema
CRISPR-Cas en A. palmae
El genoma de A. palmae J233 es
de 1 554 229 bp. En él se encontró
un sistema CRISPR completo
compuesto por una matriz de DR
más espaciadores entre la región
311 136 y 314 270 (Figura 1), con
48 DR de una longitud de 36 pb y
una secuencia consenso de las DR
conservada dentro de la matriz en un
CGTAATTTTTGCTATCTAACAAC-3’
El sistema CRISPR encontrado es del
tipo II-C al estar conformado por los
genes cas9, cas1 y cas2 ubicados entre
la región de 305 599 y 310 195 pb, y
orientados en dirección aguas arribas.
Es este sentido, la matriz CRISPR
exhibe las características típicas de
los arreglos tipo II descritos para estos
sistemas de inmunidad procariotas.
Especícamente presenta la
arquitectura que agrupa organismos
de importancia clínico-ambiental
como Neisseria meningitidis y
Campylobacter jejuni (Chylinski et
al., 2013; Chyou y Brown, 2019).
Estos presentan sistemas CRISPR
que se han asociado con funciones
no convencionales como factores de
virulencia, regulación genética, ente
otras, incluyendo la patogenicidad
hacia plantas (Westra et al., 2014).
La matriz presentó 47 secuencias
espaciadoras muy diversas, que fueron
that induced systemic resistance is
triggered by benecial members of
the root microbiome in a wide range
of plant hosts making them resistant
against various pathogenic threats.
This systemic enhancement has
also been described for many plant
growth-promoting bacteria of the
Bacillus genus (Pieterse et al., 2014).
It is well known that bacteria of the
Bacillus genus have the capability
of producing a series of bioactive
compounds with antimicrobial
activity (Raaijmakers, 2010).
The qualitative confrontation
assay of the 165 isolates against
Aspergillus spp. resulted in 15 bacilli
strains that inhibited the growth
of the fungus at different degrees
(gure 1). Antagonistic strains were
isolated from aerial part of plants
collected in the towns of Los Planes
and Todos Santos. It is known that
conditions on the plant leaves and
stem (aerial part) are harsh for
bacteria resulting in local microsites
at which conditions are favorable for
growth and/or survival (Jacobs et al.,
2005).
The conrmative confrontation
assay against Aspergillus spp., N.
dimidiatum and Alternaria spp.,
performed with the fteen bacterial
strains that showed antagonistic
activity, conrmed the grow
inhibition of fungi by some of them.
Bacterial strains presented non
regular inhibition zones on fungi
growth; therefore, length and width
measurements of the inhibition area
were documented (table 1). This
behavior was observed because some
bacteria are highly mobile.
981
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comparadas frente a una base de datos
de 4200 secuencias plasmídicas y 2718
genomas completos de bacteriófagos
según la información contenida en el
GenBank/NCBI database. Se encontró
que el 91,5% (43/47) de los espaciadores
presentaron homología con secuencias
asociadas a bacteriófagos, mientras
que el 8,5% (4/47) presentó homología
con plásmidos. El elevado número de
espaciadores dirigidos a bacteriófagos,
encontrados dentro de la matriz
CRISPR, en más del 90% en A. palmae,
imposibilita recomendar estrategias
de control biológico para evitar los
efectos citopáticos en cultivos de
tejidos basadas en el uso de virus
líticos infectivos (Fagoterapia) (São,
2018).
La predicción de la estructura
secundaria de la DR consenso mostró
una estructura termodinámicamente
estable con un ∆G de -2,90 kcal.
mol
-1
. Además se predijo un total de
otras 6439 posibles estructuras en
un rango de energía de 40 kcal.mol
-
1
por encima de la ∆G. Curiosamente,
el ∆G calculado a partir de las DR
de la matriz CRISPR de A. palmae
es termodinámicamente menos
favorable que la gran mayoría
de las DR consenso descritas al
presentar un ∆G con signo negativo
de menor magnitud (Negahdaripour
et al., 2017; Shen, 2017; Zhao et al.,
2018; Baliga, 2018), pero sin dejar
de ser una secuencia que media
la trascripción de una estructura
de ARN secundaria estable y de
formación espontánea. Sin embargo,
si bien los sistemas CRISPR tipo
II han sido los más estudiados y
aprovechados a nivel biotecnológico
Results of the molecular
identication of bacteria with
conrmed antifungal activity, showed
that all of them belong to the Bacillus
genus according to BLAST similarity
analysis (table 2). Bacillus isolates
like B. subtilis, B. methylotrophicus
and B. amyloliquefaciens have been
shown to have antagonistic activity
against common plant pathogenic
fungi. These bacteria species have
been considered efcient colonizers
that are widely spread due to their
capacity to form spores, to grow in
a wide range of temperatures and
to produce antibiotic compounds
that inhibit phytopathogens growth,
besides being plant growth promoters
(Rios-Velasco et al., 2016).
In this investigation eight strains
with antifungal activity against
Aspergillus spp., N. dimidiatum
and/or Alternaria spp., found in the
samples obtained from basil plants,
were identied and six of them belong
to B. amyloliquefaciens. This is a
microorganism that grows mainly in
the rhizosphere, it begins to grow
close to the formation point of lateral
roots and it spreads on the root surface
(Lugtenberg and Kamilova, 2005).
Nowadays, it has been demonstrated
that inoculation of crops with B.
amyloliquefaciens strains could
increase production under stressful
conditions like nutrient limitations
or high salinity levels (Kim et al.,
2017). It also has been observed
that it could help to control other
pathogens either by competing for
nutrients or by producing antibiotics
and lytic enzymes; particularly, the
molecular basis of its plant growth-
982
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Figura 1. Descripción de los elementos del sistema CRISPR-Cas9 Tipo II-C y del
tracrARN-
DR
ARN asociado en Acholeplasma palmae. (A) Representación
esquemática de los genes cas adyacentes a la matriz CRISPR. (B)
Identificación de la porción anti-repetición del tracrARN que forma el tallo
superior. La secuencia “query” (consulta, en español) es la región genómica
aguas arriba entre el gen cas9 y cas1. La secuencia “sbjct” (Sujeto) es la
secuencia de repetición CRISPR consenso. La anti-repetición detectada por
BLAST tenía una identidad del 82%. Se muestra además la región de máxima
flexibilidad de la secuencia entre el nt 50 y 60 que coincide con el segmento
“Conexión”. (C) Secuencia de bases nitrogenadas del tracrARN en el locus
CRISPR. Anti-repetición (rojo) del dúplex tracrARN-
DR
ARN, nucleótidos no
apareados que forman la protuberancia (negrita), módulo del tallo inferior
(azul). Adyacente al tallo inferior se encuentra el módulo nexo que forma
una horquilla en estructura secundaria de ARN. La secuencia “aC” previa
al segmento anti-repetición corresponde con el promotor para la secuencia
del dúplex. (D) La búsqueda prevista de tracrARN se extiende a través de
un terminador transcripcional independiente de Rho, identificado en la
figura como los nucleótidos en negrita subrayados, localizados al final de
la secuencia de tracrARN. Se muestra también la ∆G a 37ºC.
Figure 1. Description of the elements of the CRISPR-Cas9 Type II-C system and the
associated tracrRNA-
DR
RNA in Acholeplasma palmae. (A) Schematic
representation of the cas genes adjacent to the CRISPR matrix. (B)
Identification of the anti-repeat portion of the tracrRNA that forms the
upper stem. The “query” sequence is the upstream genomic region between
the cas9 and cas1 gene. The sequence “sbjct” (Subject) is the consensus
CRISPR repeat sequence. The anti-repeat detected by BLAST had 82%
identity. The region of maximum flexibility of the sequence between nt
50 and 60 that coincides with the “Connection” segment is also shown. (C)
Sequence of nitrogenous bases of tracrRNA at the CRISPR locus. Anti-
repeat (red) of the tracrRNA-
DR
RNA duplex, unpaired nucleotides forming
the bulge (bold), lower stem module (blue). Adjacent to the lower stem
is the nexus module that forms a hairpin in RNA secondary structure.
The “aC” sequence prior to the anti-repeat segment corresponds to the
promoter for the duplex sequence. (D) The predicted search for tracrRNA
extends through a Rho-independent transcriptional terminator, identified
in the figure as the underlined bold nucleotides, located at the end of the
tracrRNA sequence. ∆G at 37ºC is also shown.
983
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gracias a sus enzimas asociadas
de tipo nucleasas (Campenhout
et al., 2019; Kaushik et al., 2019),
no hay reportes sobre análisis
comparativos in silico de la ∆G de
las DR en sus matrices CRISPR. Los
análisis termodinámicos existentes
se han centrado en sistemas tipo
I-B (Negahdaripour et al., 2017),
I-C (Zhao et al., 2018), I-E (Shen,
2017), I-F (Baliga, 2018) y III-B
(Negahdaripour et al., 2017), y aunque
en la mayoría se predicen valores de
∆G ≥ -3,60 kcal.mol
-1
hay reportes
de ∆G entre -0,1 y -2,9 kcal.mol
-1
en
estos sistemas (Negahdaripour et
al., 2017; Zhao et al., 2018;), al igual
que lo predicho en este estudio. Se
encontró que pueden existir cerca
del doble de estructuras de mínima
energía a partir de la secuencia
tracrARN que las calculadas a partir
de las DR, esto posiblemente se deba
a la mayor complejidad estructural
y mayor número de interacciones
nucleotídicas de los tracrARN. Es
importante señalar que el número
de posibles estructuras, así como
su rol no ha sido aún estudiado a
profundidad en los sistemas CRISPR.
Predicción y caracterización
de las secuencias tracrARN y
DR
ARN
La porción de la región denominada
anti-repetidos del tracrARN, fue
localizada dentro de 500 nt aguas
arriba de Cas9, entre cas9 y cas1
(Figura 1). Se pudo identicar
una región de terminación Rho-
independiente en sentido 3’ a 5’ rica
en GC seguida de una región rica en
T. En relación con la ubicación del
tracrARN en A. palmae a partir de la
promoting activity is mainly based
on the production of secondary
metabolites suppressing competitive
microbial pathogens occurring in the
plant rhizosphere, secretion of the
plant growth hormone auxin and the
synthesis of volatiles stimulating
plant growth and induced systemic
resistance (Chen et al., 2009). In
addition, some B. amyloliquefaciens
strains could decrease the incidence
of nematodes in some cultivars (Liu
et al., 2013). Other species found with
antagonistic activity against fungi were
B. velezensis and B. subtilis, members
of the Bacillus genus as well and
closely related to B. amyloliquefaciens
(Rabbee et al., 2019). Also, it has been
shown that microbial colonization has
an important impact on sweet basil
quality, especially on accumulation
of important secondary metabolites
like essential oil (Banchio et al., 2009).
This outstanding ability is of great
importance when production of high-
quality products is of interest.
Strains with observed antagonistic
effect against Aspergillus spp. were
used in a germination experiment to
determine the effect of the bacteria on
total germination, length, and biomass
production of basil seedlings. The total
seed germination reached between 80
and 90 %. Figure 2 shows that all tested
bacteria had no signicant difference
on total germination of basil seeds as
compared to the control. Other reports
regarding Capsicum annuum seed
treatment with B. amyloliquefaciens
resulted in maximum enhancement of
seed germination (84.75 %), seedling
vigor (1,423.8) along with an increase
in vegetative growth parameters
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DR consenso para localizar la región
anti-repeticiones y usarla como guía
según lo recomendado (Briner et
al., 2016) se encontró que la región
anti-repeticiones presenta una alta
complementariedad con la repetición
pre-
DR
ARN y que está ubicada entre
el gen cas9 (módulo efector) y lo
genes cas1-2 (módulo de adaptación)
un arreglo de genes que solo se ha
descrito en aproximadamente el 1%
de los sistemas CRISPR tipo II-C
examinados (Chylinski et al., 2013;
Chyou y Brown, 2019), entre los que se
encuentra la bacteria Gram negativa
degradadora de la mucina intestinal
humana Akkermansia muciniphila
ATCC BAA-835 (De Vos, 2017).
Sin embargo, se observó discrepancia
en esta clasicación debido a que la
ubicación del tracrARN observada en A.
palmae ha sido denida también en los
sistemas tipo II-A (Faure et al., 2019;
Ipoutcha et al., 2019). Resultados que
corresponden con otros autores donde
se señala que la familia de tracrARN
es una familia de ARN atípica sin una
conservación obvia de la estructura,
secuencia o localización dentro de los
loci CRISPR-Cas tipo II (Chylinski et
al., 2013; Chyou y Brown, 2019; Faure
et al., 2019). Mostrando incluso genes
Cas9 alterados (Ipoutcha et al., 2019).
Esta divergencia en la clasicación del
subtipo de CRISPR en el genoma de A.
palmae considerado quizás se deba a
la propia diversidad de estos sistemas
biológicos aún en estudio, debido a que
la subcategorización de los CRISPR
está dada por los arreglos de genes, y
no por otros elementos asociados como
los transactivadores (Makarova et al.,
2011; Van der Oost, 2014). De hecho,
(Gowtham et al., 2018). Recently, a
culture-independent next-generation
sequencing-based approach was
applied to investigate the benecial
impact of B. amyloliquefaciens L-S60
on the composition and dynamics of
rhizosphere microbiota, and growth
conditions of cucumbers during
plug seedling. Application of L-S60
signicantly altered the structure of
the bacterial community associated
with the cucumber seedling. Presence
of benecial rhizosphere species
such as Bacillus, Rhodanobacter,
Paenibacillus, Pseudomonas,
Nonomuraea, and Agrobacterium was
higher upon L-S60 treatment than in
the control group (Qin et al., 2017).
Likewise, hypocotyl (gure 3A)
and radicle (gure 3B), dry biomass
accumulation did not show any
statistically signicant difference
among groups upon inoculation with
isolated antagonistic strains. It is
important to highlight that seedlings
were analyzed at early stages of
growth; in future experiments,
the impact of these strains on
morphometric characteristic of
later stages of development will be
carried out. Although, there were no
statistically signicant differences
between treatments, a tendency
to increase the dry weight can be
observed in the hypocotyl with
ALAT81 an ALMT74 and in radicle
with ALMH71 and ALMT74.
In terms of radicle length, ALAH51,
ALMR73, ALMT52, ALAT64,
ALMH71, ALMH42, ALAH91
and ALMH92 were statistically
equivalent as compared to the control.
These observations indicate that
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en el primer sistema CRISPR/Cas
reportado en A. palmae como de tipo II-
A, se identicó un gen csn2 (Ipoutcha
et al., 2019), un gen que, aunque se
considera una rma especíca de
subtipo (Ka et al., 2018), curiosamente
no fue identicado en este estudio
bajo las condiciones planteadas y con
las herramientas computacionales
propuestas.
Además, se ha reportado una mayor
relación logenética entre el sistema
II-A descrito en A. palmae con los II-C,
que con los II-B (Ipoutcha et al., 2019).
Por lo tanto, es probable que el sistema
predicho en A. palmae represente una
posible variante del sistema CRISPR
subtipo II-C con la misma ubicación del
tracrARN mostrada por los subtipos
II-A. Al mismo tiempo que se pudo
identicar la secuencia terminadora
Rho-independiente rica en Ts como se
ha reportado en estudios anteriores
(Briner et al., 2014).
Debido a las limitaciones de los
algoritmos de predicción in silico de
los promotores y los terminadores
transcripcionales, se sugiere considerar
las predicciones del promotor y del
terminador transcripcional solo como
un paso de apoyo y como parte de la
caracterización de dúplex, pero no
esencial, para la identicación de los
tracrARN, como se ha recomendado
(Chylinski et al., 2013).
Luego del análisis de las regiones
tracrARN y
DR
ARN usando BLAST,
se encontró que no existe homología
con ninguna región genómica de las
especies presentes en el GenBank/
NCBI database. La longitud de
la región tracrARN es de 107 nt,
su contenido de GC es de 39,25%.
the interaction of the mentioned
bacteria strains above did not affect
radicle growth during early seedling
development. However, the rest of the
isolated strains tested had negative
effects, some of them at higher
extend like ALMT73 and ALAT81.
On the other hand, hypocotyl length
did not show statistically signicant
difference of any of the treatments as
compared to the control (table 4).
Further experimentations will be
carried out to nd out if these Bacillus
species strains show antagonistic
activities against other important
phytopathogens if they have an impact
on basil growth and quality in terms
of essential oil and other desirable
traits. Moreover, these strains could
be used for inoculation of other plants
to investigate their biotechnological
potential.
Conclusion
To our knowledge this is the
rst time that B. amyloliquefaciens
strains have been isolated from basil
cultivars. The biotechnological use of
these bacteria to protect basil plants
against fungi is a sustainable and
reliable option to reduce crop loss
due to fungi incidence. Furthermore,
these bacteria are remarkable allies
for basil plant development due to
their ability to colonize them without
damage. The investigation carried out
and presented here in establishes the
basis for further studies on agronomic
useful these Bacillus strains that are
naturally occurring in basil plants
around La Paz, Baja California
Sur, Mexico, where we can nd very
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Presenta una masa molar de 33
250,59 Da y un Tm de 74,71 ºC, con
una región de máxima exibilidad
entre los nucleótidos 50 y 60.
La región
DR
ARN presenta una
longitud de 34 nt con un contenido de
GC de 44,12%. Su masa molecular
es de 10 530,77 Da y su Tm es de
63,21 ºC, sin regiones exibles
predecibles. El alto contenido de
pirimidinas en la región crARN y de
purinas en la tracrARN calculado
en A. palmae, y que impacta
claramente en sus temperaturas
de fusión, corresponden con lo
reportado en la literatura (Briner
et al., 2016; Chyou y Brown, 2019).
El
DR
ARN estudiado cuenta con
una estabilidad medianamente
conservada entre la región anti-
repeticiones con la repetición pre-
DR
ARN como se ha descrito (Briner
et al., 2016; Chyou y Brown, 2019).
Observaciones que muestran que
la versatilidad y ventaja del uso de
estas moléculas está estrechamente
relacionada con la exibilidad y
estabilidad termodinámica de los
complejos RNP establecidos, lo cual
puede ser clave en la especicidad
de corte como se ha señalado en
la edición programable de genes
(Kaushik et al., 2019).
Los análisis de la secuencia
genética mostraron que la región
comprendida entre el segmento
denominado nexus y la secuencia de
terminación es la región con máxima
exibilidad estructural, lo que
coincide con la secuencia localizada
entre las conformaciones tallo-bucle
típicas del módulo de terminación
del dúplex (Briner et al., 2014; Briner
distinctive environmental conditions
like extreme temperatures, high soil
salinity and drought.
Acknowledgments
This work was supported by the
Department of Agronomy at the
Universidad Autónoma de Baja
California Sur. Authors are thankful
to Yozitlali Villavicencio-Velázquez
and José Enrique Amador-Sánchez for
technical support.
et al., 2016). La elasticidad en dicha
región del tracrARN hace que el
dúplex sea susceptible a cambios
conformacionales, sin embargo,
gracias a la carencia de regiones de
menos rígidas detectables en el módulo
DR
ARN la estructura nal resultante
es termodinámicamente estable, sin
cambios importantes en términos
del tamaño expresado en radio de
los dúplex. Aspecto importante
para el aprovechamiento de este
tipo de moléculas como precursores
de sgARNs, gracias a que dicha
plasticidad y estabilidad ha permitido,
alternativamente al uso de los
sistemas naturales Cas9-tracrARN-
DR
ARN, generar un ARN quimérico
que imita el dúplex tracrARN-
DR
ARN
para un sistema de dos componentes
que combina la exibilidad del ARN de
interferencia (iARN) con la eciencia
de las enzimas de restricción (Briner
et al., 2014).
La predicción de la estructura
secundaria del dúplex tracrARN-
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DR
ARN mostró una estructura
termodinámicamente muy estable
en términos de ∆G de -79.78 kcal.
mol
-1
a 37º C (Figura 2), con un
radio ≈ 0,334 nm. Adicionalmente,
al examinar teóricamente tanto la
∆G como el tamaño del dúplex a
distintos intervalos de temperatura se
encontró que el dúplex presenta una
conformación termodinámicamente
estable en todas las temperaturas
probadas, sin cambios importantes
en un rango aproximado de 29 ºC,
especícamente entre 13 ºC y 41 ºC. Solo
se predijo cambios conformacionales
en relación a su radio a temperaturas
≤ 12º C y a ≥ 42 ºC , con radios de 0,380
nm y 0,323 nm, respectivamente.
Aunque se observó un aumento en
el tamaño teórico del dúplex a bajas
temperaturas, y una disminución a
altas temperaturas, la diferencia del
tamaño en el valor absoluto entre
las conformaciones sometidas a los
valores extremos de temperatura
probadas fue de apenas ≈ 0,057 nm,
este aspecto promueve la estabilidad
conformacional. Curiosamente,
aunque se ha descrito que otros
sistemas CRISPR se ven afectados
y modulados de manera importante
por variaciones en la temperatura
(Høyland-Kroghsbo et al., 2018), en
esta investigación el complejo genético
estudiado muestra una estabilidad,
conformación y termodinámica poco
variable en función de la temperatura.
Posiblemente esto se deba a que
estos sistemas son dependientes del
correcto funcionamiento de ambos
módulos tracrARN-
DR
ARN (Makarova
et al., 2011), lo que justicaría que el
dúplex forme parte de un mecanismo
medianamente conservado, como se
ha descrito para otras estructuras
CRISPR (Kunin et al., 2007).
En la Figura 2 se muestra la
estabilidad conformacional en relación
al ∆G del dúplex, el cual se muestra
con un tamaño aproximado en términos
de radio de 0,334 nm. Adicionalmente,
se evidencia una conformación
termodinámicamente estable en la
mayoría de las temperaturas probadas,
sin cambios importantes en un rango
entre 13 ºC y 41 ºC. Solo se predijo
cambios conformacionales en relación a
su volumen a temperaturas ≤ 12º C y a ≥
42 ºC, con tamaños calculados de 0,380
nm y 0,323 nm, respectivamente. Todas
las estructuras predichas resultaron
conformaciones termodinámicamente
favorables.
En relación con la ∆G, la media
termodinámica entre 37 º y 23 ºC
fue de ≈ 9 kcal.mol
-1
. Mientras que
a las temperaturas extremas de
este estudio fue ≤ 4 kcal.mol
-1
. Es
importante destacar que la diferencia
termodinámica en términos de valor
absoluto entre los valores extremos de
temperatura probados fue de ≈ 38 kcal.
mol
-1
. Se predijo además un total de
otras 10.193.838 posibles estructuras de
mínima energía y por lo tanto factibles
en su formación a partir de la secuencia
tracrARN en un rango de energía de 15,3
kcal.mol
-1
por encima de la ∆G. Por otro
lado, las energías de acoplamiento entre
la Cas9 y las regiones del dúplex fueron
muy cercanas y termodinámicamente
favorecidas según la función de
puntuación HDOCK, siendo estas de
-217,14 kcal.mol
-1
para la región
DR
ARN,
y -200,66 kcal.mol
-1
para la región
tracrARN.
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Curiosamente, la función de
puntuación MolDock Score solo predijo
un acoplamiento termodinámicamente
favorecido entre la nucleasa y la región
DR
ARN (-409,367 kcal.mol
-1
) contrario
a lo calculado entre la región tracrARN
y Cas9 (25 449,706 kcal.mol
-1
) con una
interacción no favorable (Figura 3). La
función de puntuación MolDock Score
mostró discrepancias y solo predijo
un acoplamiento favorecido entre la
nucleasa y la región
DR
ARN, calculando
una interacción no favorable con la
región tracrARN. Esto puede deberse
quizás a limitaciones en el algoritmo
MolDock como el requerimiento de
la preparación de los complejos en
el software Molegro Virtual Docker
(MVD-v.7.0.0) antes del análisis con
el MMV (Thomsen y Christensen,
2006; Azeez et al., 2012) y en este
Figura 2. Cambios conformacionales y termodinámicos del dúplex
tracrARN-
DR
ARN en A. palmae a los intervalos extremos de
temperatura probados.
Figure 2. Conformational and thermodynamic changes of the tracrRNA-
DR
RNA duplex in A. palmae at the extreme temperature ranges
tested.
estudio el complejo fue preparado y
ensamblado en el software HDOCK
por la naturaleza del ligando (Yan et
al., 2017), o posiblemente por el gran
tamaño de la secuencia tracrARN
utilizada. Sin embargo, en todos los
casos las interacciones observadas
están representadas por múltiples
puentes de hidrogeno, interacciones
electrostáticas y estéricas, las
cuales facilitan un acoplamiento
termodinámicamente favorecido entre
los módulos del trans-activador y la
nucleasa, especialmente con la región
DR
ARN, y que en conjunto conforman
una estructura que permite un
estable ensamblaje del complejo
RNP, promoviendo un eciente
reconocimiento de las secuencias
dianas y el consecuente clivaje (Lau y
Davie, 2017).
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En la Figura 3 se muestran las
energías de acoplamiento entre
la Cas9 y las regiones del dúplex
las cuales fueron muy cercanas y
termodinámicamente favorecidas
según la función de puntuación
HDOCK. Las energías fueron -217,14
kcal.mol
-1
para la región
DR
ARN, y
-200,66 kcal.mol
-1
para la región
tracrARN. La función de puntuación
MolDock Score solo predijo un
acoplamiento termodinámicamente
favorecido entre la nucleasa y la región
DR
ARN (-409,367 kcal.mol
-1
) contrario
a lo calculado entre la región tracrARN
y Cas9 (25449,706 kcal.mol
-1
) con una
interacción no favorable, sin embargo,
en todos los casos el software MMV
predijo
interacciones representadas
por puentes de hidrógeno,
interacciones electrostáticas y
estéricas. Es importante señalar
que si bien, este trabajo se centró
en la caracterización del dúplex
tracrARN-
DR
ARN, incluyendo
su energía de interacción con la
nucleasa Cas9. Esto fue predicho a
partir de la secuencia reportada en el
GenBank/NCBI y según los modelos
tridimensionales presentes en el
Protein Data Bank. Estos modelos
fueron utilizados como plantilla por
SWISS-MODEL y luego renados
con HDOCK, al no existir para el
momento de realizado este estudio
una cristalografía de la endonucleasa
Cas9 asociada a CRISPR en A.
palmae. El modelo utilizado estuvo
representado por una estructura con
una cobertura del 90 %, pero con
una identidad de solo el 40 % con la
estructura cristalina de la Cas9 de
Staphylococcus aureus. Un resultado
que muestra una gran diversidad
proteica y la poca similitud a nivel
de esta nucleasa entre A. palmae y
el resto de los grupos microbianos
relacionados en términos de sistemas
CRISPR. Lo cual puede contribuir
con la predicción de anidades
diferentes y, por ende, con resultados
contradictorios. Por lo tanto, se
recomienda realizar un número
mayor de predicciones de energía
relativa de unión considerando otros
tipos de Cas9, especialmente porque
existe una gran diversidad de estas
moléculas (Bae et al., 2014), así
como reportes de variantes alteradas
estrechamente relacionadas
(Ipoutcha et al., 2019), con la nalidad
de validar la metodología empleada.
A
dicionalmente, se sugiere
modelar diversas conformaciones
de la secuencia tracrARN-
DR
ARN,
así como realizar acoplamientos
macromoleculares del dúplex
completo con las nucleasas
consideradas porque nuestro enfoque
se centró en estudiar la anidad
de la nucleasa sobre los elementos
individuales del dúplex porque
se sabe que la Cas9 interacciona
fuertemente con la región tracrARN
al mismo tiempo que participa en
la maduración de la región
DR
ARN
(Jinek et al., 2012).
Conclusión
El uso de herramientas
bioinformáticas permiten la
predicción y estudio de sistemas
CRISPR-Cas tipo II y de sus
elementos claves para la edición
genética en el toendosimbionte A.
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Figura 3. Acoplamiento macromolecular de las regiones del dúplex
tracrARN-
DR
ARN con la Cas9 en A. palmae.
Figure 3. Macromolecular docking of the regions of the tracrRNA-
DR
RNA
duplex with Cas9 in A. palmae.
palmae. Estas estrategias ofrecen
alternativas teóricas diversas para
los sistemas CRISPR comerciales
aplicables a la biotecnología vegetal.
Se requieren más estudios, así como
demostraciones experimentales
en modelos celulares. Este estudio
representa el primer reporte sobre
la estabilidad termodinámica y el
acopamiento molecular de elementos
asociados al dúplex tracrARN-
DR
ARN
en la especie tosimbionte A. palmae.
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