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Rev. Fac. Agron. (LUZ). 2021, 38(4): 951-969. Octubre-Diciembre.
DOI: https://doi.org/10.47280/RevFacAgron(LUZ).v38.n4.12 ISSN 2477-9407
Esta publicación científica en formato digital es continuación de la Revista Impresa: Depósito legal pp 196802ZU42, ISSN 0378-7818.
Received el 14-02-2021 . Accepted el 28-05-2021.
*Autor de correspondencia. Correo electrónico:
hgill@ipn.mx; jggarcia@ipn.mx
Characterization of rhizospheric bacteria isolated
from soil cultivated with sugarcane in Tamaulipas
state, Mexico
Caracterización de bacterias rizosféricas aisladas de suelo
cultivado con caña de azúcar en el estado de Tamaulipas,
México
Caracterização de bactérias rizosféricas isoladas de solo
cultivado com cana-de-açúcar no estado de Tamaulipas,
México
Jesús Gerardo García Olivares
1
, Martín Abraham Reyes
Lara
2
, Juan ores Gracía
2
, Jesús Di Carlo Quiroz Velásquez
1
,
Israel García León
1
, José Reyes Hernández
3
y Homar Rene
Gill Langarica
1*
1
Centro de Biotecnología Genómica-Instituto Politécnico Nacional,
Reynosa, Tamaulipas,
México C.P. 88710. Correo electrónico: (JG) jggarcia@ipn.mx, ; (JQ) jquiroz@ipn.
mx, ; (IG)
1e
igleon00@gmail.com, ; (HG) hgill@ipn.mx, .
2
Instituto Tecnológico
de Cd. VictoriaCd. Victoria, Tamaulipas, México C.P. 87010. Correo electrónico: (MR)
tinorey_90@hotmail.com, ; (JG) joresgracia@yahoo.com.mx, .
3
Universidad
Autónoma de Tamaulipas Unidad Académica Multidisciplinaria Mante, Col. Jardín C.P.
89840, México. Correo electrónico: biologo.reyes@hotmail.com, .
Abstract
The state of Tamaulipas, Mexico, has two important sugar mills, with
plantations of sugarcane (Saccharum ofcinarum L.) of more than 50 years, the
objective of the study was the identication and bacterial characterization in
the production of indole-3-acetic acid (IAA), the solubilization of phosphorus and
plant growth of bacterial isolates from the rhizosphere of sugarcane. The isolation
and morphological characterization were in 30 rhizosphere soil samples of the
sugarcane variety CP 72-2086 using the Luria-Bertani media, Congo Red Agar and
Potato Dextrose Agar. The molecular characterization was with the 16S rRNA gene
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and the bacterial inoculation consisted of seedlings of the variety CP 72-2086. 121
strains (38 species) were isolated, being Bacillus sp. most frequently, 14 species
were positive for phosphorus solubilization: Bacillus sp. (6), Pseudomonas spp. (5),
Paenibacillus (2) Streptomyces venezuelae (1) stand out. The greater phosphorus
solubilization was Pseudomonas mediterranea (21.6 mm). Nine bacteria showed
production close to 5 ppm IAA: Bacillus aryabhattai (6 ppm), Bacillus pumilus
(5.8 ppm) and Ensifer adhaerens (5.6 ppm). Bacillus megaterium showed a higher
percentage of chlorophyll and foliar nitrogen. In the present analysis, 38 bacterial
species associated with the rhizosphere of the sugarcane variety CP 72-2086 were
identied, so these results showed the potential to select native bacteria that have
the ability to stimulate plant growth of the variety CP 72-2086.
Key words: Saccharum ofcinarum L., Bacillus spp., indole-3-acetic acid (IAA),
phosphorus.
Resumen
El estado de Tamaulipas, México, cuenta con dos ingenios azucareros
importantes, con plantaciones de caña de azúcar (Saccharum ofcinarum L.) de
más de 50 años, el objetivo del estudio fue la identicación y la caracterización
bacteriana en la producción de ácido indol-3-acético (IAA), la solubilización de
fósforo y crecimiento vegetal de aislados bacterianos de la rizosfera de caña de
azúcar. El aislamiento y la caracterización morfológica fue en 30 muestras de suelo
de la rizosfera de la variedad de caña de azúcar CP 72-2086 usando los medios
Luria-Bertani, agar rojo congo y agar papa dextrosa. La caracterización molecular
fue con el gen 16S rRNA y la inoculación bacteriana consistió en plántulas de
la variedad CP 72-2086. Se aislaron 121 cepas, Bacillus sp. fue la bacteria más
frecuente, 14 especies fueron positivos a fósforo, Bacillus sp. (6), Pseudomonas spp.
(5), Paenibacillus (2) Streptomyces venezuelae (1). La mayor solubilización de fósforo
fue para Pseudomonas mediterranea (21,6 mm). Nueve bacterias presentaron una
producción cercana a 5 ppm de IAA, sobresalen Bacillus aryabhattai (6 ppm),
Bacillus pumilus (5,8 ppm) y Ensifer adhaerens (5,6 ppm). Bacillus megaterium
mostró mayor porcentaje de clorola y nitrógeno foliar. En el presente análisis se
lograron identicar 38 especies bacterianas asociadas a la rizosfera de la variedad de
caña de azúcar CP 72-2086, por lo que estos resultados mostraron el potencial para
seleccionar bacterias nativas que tienen la capacidad de estimular el crecimiento
vegetal de la variedad CP 72-2086.
Palabras clave: Saccharum ofcinarum L., Bacillus spp., ácido indol-3-acético
(IAA), fósforo.
Resumo
O estado de Tamaulipas, no México, possui duas importantes usinas açucareiras,
com plantações de cana-de-açúcar (Saccharum ofcinarum L.) de mais de 50 anos,
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Introducción
El cultivo de la caña de azúcar
(Saccharum ofcinarum L.) en México
es una actividad de gran importancia
en la economía nacional, es un cultivo
que permite una amplia diversidad
productiva, ejemplo en Tamaulipas
los ingenios azucareros “Aarón Sáenz
Garza” y “El Mante” generan un gran
derrame económico (Castro-Nava
et al., 2010). La actividad derivada
del cultivo de la caña de azúcar en
las zonas productoras de México
no solo se ve afectada productiva y
económicamente por factores bióticos
y abióticos también se cultiva bajo el
sistema de monocultivo, práctica que
ha empobrecido y degradado los suelos
(Solanki et al., 2017). Estas condiciones
se han visto agravadas por prácticas
que aplican altas cantidades de
o objetivo do estudo foi a identicação e caracterização bacteriana na produção
de ácido indol- 3- ácido acético (IAA), solubilização de fósforo e crescimento de
plantas de isolados bacterianos da rizosfera da cana-de-açúcar. O isolamento e a
caracterização morfológica foram realizados em 30 amostras de solo da rizosfera da
variedade de cana-de-açúcar CP 72-2086 utilizando os meios Luria-Bertani, ágar
vermelho do Congo e ágar batata dextrose. A caracterização molecular foi com o
gene 16S rRNA e a inoculação bacteriana consistiu em mudas da variedade CP
72-2086. 121 cepas, Bacillus sp. foi a bactéria mais frequente, 14 espécies foram
positivas para fósforo, Bacillus sp. (6), Pseudomonas spp. (5), Paenibacillus (2)
Streptomyces venezuelae (1). A maior solubilização de fósforo foi para Pseudomonas
mediterranea (21,6 mm). Nove bactérias apresentaram produção próxima a 5 ppm
de IAA, destacando-se Bacillus aryabhattai (6 ppm), Bacillus pumilus (5,8 ppm) e
Ensifer adhaerens (5,6 ppm). Bacillus megaterium apresentou maior porcentagem
de clorola e nitrogênio foliar. Na presente análise, foram identicadas 38 espécies
bacterianas associadas à rizosfera da variedade de cana-de-açúcar CP 72-2086,
portanto esses resultados mostraram o potencial para selecionar bactérias nativas
que têm a capacidade de estimular o crescimento de plantas da variedade CP 72-
2086.
Palabras-chave: Saccharum ofcinarum L., Bacillus spp., ácido indol-3-acético
(IAA), fósforo.
Introduction
The sugarcane (Saccharum
ofcinarum L.) cultivation in Mexico
is one activity of major importance in
the national economy, it is a crop that
allows a wide production diversity,
an example in Tamaulipas sugar
mills “Aarón Sáenz Garza” and “El
Mante” generate a great economic
spill (Castro-Nava et al., 2010). The
activity derived from sugarcane
cultivation in Mexico producing areas
is not only affected productively and
economically by biotic and abiotic
factors also is cultivated under the
monoculture system, a practice that
has impoverished and degraded soil
(Solanki et al., 2017). Conditions that
have been aggravated by practices
applying high agrochemicals amounts
and chemical fertilizers (Torriente,
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2010). Therefore, it is necessary to
investigate cultivation technologies
are protable and do not affect
environment with more sustainable
cultivation practices.
One way to temper bad practices is
through soil microora study, coupled
with implementation agricultural
practices that stimulate native
populations of microorganisms in
sugarcane rhizosphere cultivation,
growth and health of plants (Momose
et al., 2009; Ashraf et al., 2011;
Saharan and Nehra, 2011), since
we must take advantage of fact
soil microorganisms are associated
with crops, based on those interact
positively with plants (Morgan et al.,
2005; Bhattacharyya and Jha, 2012;
Quecine et al., 2012), and also from
adaptive point view, plants select
microorganisms that contribute
most its development, for example,
bacteria
of genus Pseudomonas,
Azospirillum, Azotobacter, Klebsiella,
Enterobacter, Alcaligens, Arthrobacter,
Burkholderia, Bacillus and Serratia,
among others can colonize plant
tissue (Saharan and Nehra, 2011;
Criollo et al., 2012), as well as fungi
that have been proven to promote
plant growth such as those of genus
Trichoderma, which has been reported
that stimulate growth grasses such
as sorghum and maize among others
plants (Hernández-Mendoza et al.,
2018).
Investigations show potential to
select in situ microorganisms with
potential to optimize assimilate
nutrients and possess substances
stimulate plant growth or act as
bioinsecticides or biofungicides,
agroquímicos y fertilizantes químicos
(Torriente, 2010). Por lo tanto, es
necesario investigar las tecnologías de
cultivo que sean rentables y no afecten
el medio ambiente con prácticas de
cultivo más sostenibles.
Una forma de moderar las malas
prácticas es mediante el estudio de
la microora del suelo, junto con la
implementación de prácticas agrícolas
que estimulen las poblaciones nativas
de microorganismos en el cultivo, el
crecimiento y la salud de las plantas
en la rizosfera de la caña de azúcar
(Momose et al., 2009; Ashraf et al.,
2011; Saharan y Nehra, 2011), ya que
debemos aprovechar el hecho de que
los microorganismos del suelo están
asociados con los cultivos, en base a
que estos interactúan positivamente
con las plantas (Morgan et al., 2005;
Bhattacharyya y Jha, 2012; Quecine
et al., 2012), y también desde el
punto de vista adaptativo, las plantas
seleccionan los microorganismos que
más contribuyen a su desarrollo,
por
ejemplo, bacterias de los
géneros Pseudomonas, Azospirillum,
Azotobacter, Klebsiella, Enterobacter,
Alcaligens, Arthrobacter, Burkholderia,
Bacillus y Serratia, entre otros pueden
colonizar tejido vegetal (Saharan y
Nehra, 2011; Criollo et al
., 2012), así
como hongos que han demostrado
promover el crecimiento de las plantas
como los del género Trichoderma,
que se ha reportado que estimulan el
crecimiento de gramíneas como sorgo y
maíz entre otras plantas (Hernández-
Mendoza et al., 2018).
Las investigaciones muestran
potencial para seleccionar
microorganismos in situ con potencial
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because they are native microbiota
and have a high degree adaptation.
Therefore, to know the bacterial
diversity associated with the
cultivation of sugarcane and its
potential as biofertilizers, is a rst
step to take advantage of the benets
that lead to the association of the
sugarcane plant and rhizobacteria
in the productive system of sugar
mills “Aarón Sáenz Garza” and “El
Mante” in Tamaulipas Mexico, for
these reasons, the main objective
of the study was to evaluate the
production of indole-3-acetic acid, the
solubilization of mineral phosphorus
and the production of shoots in the
greenhouse from bacteria isolated
from the rhizosphere of sugarcane
cultivated in calcareous soils from the
state of Tamaulipas, Mexico.
Materials and methods
Location. For this study, soils of
sugarcane mills in the municipalities
El Mante (latitude N 22º74’78.30” and
length E 98º98’27.99”), Gómez Farías
(latitude N 22º42’32” and length E
0º30’43”) and Xicoténcatl (latitude
N 22º59’00” and length E 98º57’00”)
from Tamaulipas state, Mexico, were
selected. The microbiology study was
carried out in soil grow with sugarcane
variety CP 72-2086.
Soil samples collection and
samples preparation. In 30 randomly
chosen plots, ve soil samples were
collected from the rhizosphere of
the sugarcane plant. Samples were
collected at a depth 30 cm composed
of ve points in each lot and
subsequently homogenized and dried
para optimizar la asimilación de
nutrientes y poseer sustancias que
estimulen el crecimiento de las
plantas o actúen como bioinsecticidas
o biofungicidas, debido a que son
microbiota nativa y tienen un alto
grado de adaptación. Por tanto,
conocer la diversidad bacteriana
asociada al cultivo de la caña de azúcar
y su potencial como biofertilizantes,
es el primer paso para aprovechar
los benecios que conllevan la
asociación de la planta de caña de
azúcar y rizobacterias en el sistema
productivo de los ingenios azucareros
“Aarón Sáenz Garza “y” El Mante “en
Tamaulipas México, por estas razones,
el objetivo principal del estudio fue
evaluar la producción de ácido indol-
3-acético, la solubilización de fósforo
mineral y la producción de brotes
en invernadero a partir de bacterias
aisladas de la rizosfera de caña de
azúcar cultivada en suelos calcáreos
del estado de Tamaulipas, México.
Materiales y métodos
Localización. Para este estudio,
fueron seleccionados suelos de ingenios
de caña de azúcar en los municipios
El Mante (latitud N 22º74’78.30”
y longitud E 98º98’27.99”), Gómez
Farías (latitud N 22º42’32” y longitud
E 0º30’43”) y Xicoténcatl (latitud N
22º59’00” y longitud E 98º57’00”) del
estado de Tamaulipas, México. El
estudio de microbiología se realizó en
suelo de cultivo con caña de azúcar
variedad CP 72-2086.
Toma de muestras de suelo
y preparación de muestras. En
30 parcelas elegidas al azar, se
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in shade. Bacterial isolation consisted
of using 1 g of soil diluted in sterile
isotonic saline, 100 µL of the dilution
in triplicate was placed in sterile
Petri dishes with growth medium and
incubated at 30 °C for 48 hours. The
selection of the colonies was carried
out by morphology and the counting of
the colonies was done by the method
of Swanson et al. (2001), three culture
media, Luria-Bertani (LB), congo red
agar and potato dextrose agar (PDA)
were used for bacterial isolation
(Berkhoff and Vinal, 1986).
Molecular identication. The
protocol PrepMan® Ultra Sample
Preparation Reagent of Applied
Biosystems for DNA was used
(Mullis and Faloona, 1987), the
protocol allowed to perform a PCR
directly. The 16S rRNA gene was
amplied using universal primer Sx-
(AGAGTTTGATCMTGGCTCAG) and
Ay-(ACCTTGTTACGACTT) (Naveed
et al., 2014). Amplication cycle was
included an initial denaturation (94
ºC, 5 min), 30 cycles consisted of 1 min
at 94 °C for denaturation, 40 s at 58
°C for annealing and 150 s at 72 °C for
elongation, followed 10 min at 72 °C
nal extension. Target amplication
was conrmed by electrophoresis in
1 % agarose. The PCR products were
sequenced and compared with 16S
rRNA gene sequences present in the
NCBI GenBank.
Based on a literature review, a
percentage of the bacterial isolates
were selected to produce IAA,
mineral phosphorus solubilization,
and greenhouse plant inoculation
tests. For phosphorus solubilization,
Pikovskaya agar medium (PVK) with
recolectaron cinco muestras de
suelo de la rizósfera de la planta
de caña de azúcar. Las muestras se
recolectaron a una profundidad de
30 cm, estuvo compuesta por cinco
puntos en cada lote, posteriormente se
homogeneizaron y secaron a la sombra.
El aislamiento bacteriano consistió en
utilizar 1 g de suelo diluido en solución
salina isotónica estéril, se colocaron
100 µL de la dilución por triplicado en
placas de Petri estériles con medio de
cultivo y se incubaron a 30 °C durante
48 horas. La selección de las colonias
se realizó por morfología y el recuento
de las colonias se realizó por el método
de Swanson et al. (2001), se utilizaron
tres medios de cultivo, Luria-Bertani
(LB), agar rojo congo y agar papa
dextrosa (PDA) para el aislamiento
bacteriano (Berkhoff y Vinal, 1986).
Identicación molecular. Se utilizó
el protocolo PrepMan® Ultra Sample
Preparation Reagent de Applied
Biosystems para ADN (Mullis y
Faloona, 1987), el protocolo permitió
realizar una PCR directamente.
El gen de ARNr 16S se amplicó
utilizando el cebador universal Sx-
(AGAGTTTGATCMTGGCTCAG) y
Ay- (ACCTTGTTACGACTT) (Naveed
et al., 2014). El ciclo de amplicación
incluyó una desnaturalización
inicial (94 ºC, 5 min), 30 ciclos
consistieron en 1 min a 94 °C para
la desnaturalización, 40 s a 58
°C para el recocido y 150 s a 72 °C
para el alargamiento, seguidos de
10 min a Extensión nal 72 °C. La
amplicación diana se conrmó
mediante electroforesis en agarosa
al 1 %. Los productos de la PCR se
secuenciaron y compararon con las
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purple bromocresol solution was used
as culture pH indicator (changes from
violet to yellow), which indicates the
medium acidication. 10 µL of each
strain were cultured in PVK medium
plates and incubated for 7 days at 30
°C. The appearance of a clear zone
around the colony was considered as
its phosphate solubility capacity. The
phosphorus solubility index (SI) was
calculated from relationship between
the diameter of colony and halo zone
(Nopparat et al., 2009).
Biochemical characterization.
In IAA analysis, the strains were
grown in LB liquid medium for 24 and
48 h and ltered with 0.45 μm nylon
membranes (Millipore), each sample
was composed of 3 mL deionized
water and 3 mL of a suspension
1.10
6
cells.mL
-1
. HPLC analysis was
performed by injecting 20 μL of each
ltered sample and as a standard
IAA solution. All sample analysis was
transformed in mobile phase 70/30
(700 mL of phosphate solution and
300 mL of acetonitrile) with pH 3.2,
a ow rate 1 mL
.
min
-1
for 25 min at
30 °C, UV light detector at 220 nm
and column ultra-pore of 150*4.6mm
(Arora and Bae, 2014).
Greenhouse test. The effect as
bio stimulators of plant growth of
nine isolated bacteria selected for
their production of IAA a phosphorus
solubilization was evaluated in a
greenhouse in 20 seedlings sugarcane
variety CP 72-2086 (Bacillus
aryabhattai, B. licheniformis, B.
megaterium, B. pumilus, B. simplex, B
subtilis, Brevundimonas aurantiaca,
Ensifer adhaerens, Pseudomonas
sp. and control). The analysis was
secuencias del gen del ARNr 16S
presentes en el NCBI GenBank.
En base a una revisión de la
literatura, se seleccionó un porcentaje
de los aislados bacterianos para producir
IAA, solubilización de fósforo mineral e
inoculación de plantas de invernadero.
Para la solubilización del fósforo se utilizó
medio de agar Pikovskaya (PVK) con
solución de bromocresol púrpura como
indicador del pH del cultivo (cambios
de violeta a amarillo), lo que indica la
acidicación del medio. Se cultivaron 10
µl de cada cepa en placas de medio PVK
y se incubaron durante 7 días a 30 ºC. La
aparición de una zona clara alrededor de
la colonia se consideró como su capacidad
de solubilidad de fosfato. El índice de
solubilidad del fósforo (SI) se calculó a
partir de la relación entre el diámetro de
la colonia y la zona del halo (Nopparat et
al., 2009).
Caracterización bioquímica.
En el análisis IAA, las cepas se
cultivaron en medio líquido LB durante
24 y 48 h y se ltraron con membranas
de nylon de 0,45 μm (Millipore),
cada muestra estuvo compuesta
por 3 mL de agua desionizada y
3 mL de
una suspensión de 1.10
6
células.mL
-1
.
El análisis por HPLC
se realizó inyectando 20 μL de cada
muestra ltrada y como una solución
estándar de IAA. Todo el análisis de la
muestra se transformó en fase móvil
70/30 (700 mL de solución de fosfato y
300 mL de acetonitrilo) con pH 3,2, un
caudal de
1 mL
.
min
-1
durante 25 min
a 30 °C, detector de luz UV a 220 nm
y columna ultra-pore de 150*4,6 mm
(Arora y Bae, 2014).
Prueba de invernadero. Se
evaluó el efecto como bioestimuladores
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carried in El Mante municipality in
Tamaulipas state, Mexico (latitude
N 22º74’78.30” and length E 98º98’
27.99”). Each sugarcane seedling of
cultivar CP 72-2086 was transplanted
in bags with substrate composted
cachaça (six kilograms) 10 cm to
depth. One milliliter each strain
bacterial was applied to root. The
Chlorophyll and nitrogen content and
shoots number were evaluated.
Statistical analysis and
experimental design. For the
bacterial evaluation in production
phosphorus solubilization and
greenhouse test, a completely
randomized block experimental
design was used with three repetitions
for phosphorus solubilization and 20
repetitions (plants) for the greenhouse
test. For the two evaluations an
ANOVA and Tukey’s means test were
applicate (P = 0.05) in the software
InfoStat v2019 (Di Rienzo et al.,
2019). For the phylogenetic tree
was constructed with the Kimura
2-parameters method (Kimura, 1980)
and the maximum probability with
a resampling of 10,000 repetitions
(Felsenstein, 1985) and the MEGA
V6.0 software was used.
Results and discussion
Bacterial diversity. Morphology
isolation allowed identication of
121 pure isolates from sugarcane
rhizosphere, identication based on
16S rRNA gene allowed identication
of 38 species grouped in nine genera
and three phyla, Actinobacteria,
Proteobacteria and Firmicutes.
Of total species identied, the
del crecimiento vegetal de nueve
bacterias aisladas seleccionadas para
su producción de IAA a solubilización
de fósforo en invernadero en 20
plántulas de caña de azúcar variedad
CP 72-2086 (Bacillus aryabhattai,
B. licheniformis, B. megaterium,
B. pumilus, B. simplex, B subtilis,
Brevundimonas aurantiaca, Ensifer
adhaerens, Pseudomonas sp. y
control). El análisis se realizó en
el municipio El Mante en el estado
de Tamaulipas, México (latitud
N 22º74’78,30” y longitud E 98º98
‘27,99”)
. Cada plántula de caña de
azúcar del cultivar CP 72-2086 se
transplantó en bolsas con sustrato
compostado de
cachaza (seis
kilogramos) a 10 cm de profundidad.
Se aplicó a la raíz un mililitro de
cada cepa bacteriana. Se evaluó el
contenido de clorola y nitrógeno y el
número de brotes.
Análisis estadístico y diseño
experimental. Para la evaluación
bacteriana en producción de
solubilización de fósforo y prueba
de invernadero, se utilizó un
diseño experimental de bloques
completamente al azar con tres
repeticiones para la solubilización de
fósforo y 20 repeticiones (plantas) para
la prueba de invernadero. Para las dos
evaluaciones se aplicaron ANAVAR
y prueba de medias de Tukey (P =
0,05) en el software InfoStat v2019
(Di Rienzo et al., 2019). Para el árbol
logenético se construyó con el método
de 2 parámetros de Kimura (Kimura,
1980) y máxima probabilidad con un
remuestreo de 10.000 repeticiones
(Felsenstein, 1985) y el software
MEGA V6.0.
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genera Bacillus, Pseudomonas and
Arthrobacter grouped largest number
of species. At phylum level, the phylum
Firmicutes grouped largest number of
species (26), Proteobacteria eight and
Actinobacteria four species (gure 1).
Figure 1. Phylogenetic relationship of 16S rRNA gene in bacteria isolated
from sugarcane rhizosphere grown in southern Tamaulipas
state, Mexico.
Figura 1. Relación filogenética del gen 16S rRNA en bacterias aisladas de
la rizosfera de caña de azúcar cultivada en el sur del estado de
Tamaulipas, México.
The results in bacterial diversity
found in this work coincide with that
reported by Dhanraj (2013), who
found a similar number of phyla and
bacterial genera in the rhizosphere
of sugarcane and that reported by
Cordero et al. (2020) in the rhizosphere
of the other crops as canola, wheat, eld
pea and lentil. In this work, 38 species
located in three phyla were identied,
Actinobacteria, Proteobacteria and
Firmicutes, 50 % of the bacteria
belonged to the genus Bacillus within
the phylum Firmicutes. Pisa et al.
(2011), found in their investigation
Resultados y discusión
Diversidad bacteriana. El
aislamiento morfológico permitió
identicar 121 aislados puros de la
rizósfera de la caña de azúcar, la
identicación basada en el gen 16S
rRNA permitió identicar 38 especies
agrupadas en nueve géneros y tres
los, Actinobacteria, Proteobacteria
y Firmicutes. Del total de especies
identicadas, los géneros Bacillus,
Pseudomonas y Arthrobacter agruparon
el mayor número de especies. A nivel de
lo, el lo Firmicutes agrupó el mayor
número de especies (26), Proteobacteria
ocho y Actinobacteria cuatro especies
(gura 1).
Los resultados en diversidad
bacteriana encontrados en este trabajo
coinciden con lo reportado por Dhanraj
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of sugarcane rhizosphere that genus
Bacillus is present in 19.7 % more
than other genera found and as well as
Männistö et al. (2013), who reported
that Bacillus genus had a greater
presence in soils cultivated with crops
of commercial interest (Cordero et al.,
2020).
The wide presence of genus
Bacillus in soils cultivated with
sugarcane, may be related to fact that
genus Bacillus species could produce
spores, which allows each species to
tolerate unfavorable environmental
conditions compared to other genera
(Galperin, 2013). Furthermore, it
is known that Bacillus strains are
producers lipopeptide biosurfactants
of surfactin, iturin and fengycin
families that demonstrate biological
activity with a synergistic mode of
action (Heryania and Dharma Putrab,
2017).
In addition, surfactin shows
antibacterial, antiviral, antiparasitic
properties and triggers formation of
biolms, which are essential for root
colonization, Iturin and fengycin
exhibit antifungal activity against a
wide range of yeast and lamentous
fungi, together stimulate an induced
systemic response (ISR) in host
plants, for what are considered
microorganisms with industrial and
agricultural potential (Lim et al.,
2017).
Phosphorus solubilization. Of
38 species of detected bacteria, only
one isolate per species was analyzed
for phosphorus solubilization, the
result showed that less than 50 % of
the strains can solubilize insoluble
phosphorus, the same result was
(2013), quien encontró un número
similar de phyla y géneros bacterianos
en la rizosfera de la caña de azúcar y
al reportado por Cordero et al. (2020)
en la rizósfera de los otros cultivos
como canola, trigo, guisante y lentejas.
En este trabajo se identicaron 38
especies ubicadas en tres phyla,
Actinobacteria, Proteobacteria y
Firmicutes, el 50 % de las bacterias
pertenecían al género Bacillus dentro
del Phylum Firmicutes. Pisa et al.
(2011), encontraron en su investigación
de la rizósfera de la caña de azúcar
que el género Bacillus está presente
en un 19,7 % más que otros géneros
encontrados y al igual que Männistö
et al. (2013), quienes reportaron que
el género Bacillus tuvo una mayor
presencia en suelos cultivados con
cultivos de interés comercial (Cordero
et al., 2020).
La amplia presencia del género
Bacillus en suelos cultivados con caña
de azúcar, puede estar relacionada con
el hecho de que las especies del género
Bacillus podrían producir esporas, lo
que permite que cada especie tolere
condiciones ambientales desfavorables
en comparación con otros géneros
(Galperin, 2013). Además, se sabe que
las cepas de Bacillus son productoras
de biosurfactantes lipopéptidos de
las familias de surfactina, iturina y
fengycina que demuestran actividad
biológica con un modo de acción
sinérgico (Heryania y Dharma Putrab,
2017).
Además, la surfactina muestra
propiedades antibacterianas,
antivirales, antiparasitarias y
desencadena la formación de
biopelículas, que son esenciales para
961
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reported by Mohammadi (2012),
who observed a lower efcacy than
50 % in solubilization insoluble
phosphorus. The variance analysis
was highly signicant for phosphorus
solubilization time (24, 48 and 72 h)
and treatments (bacterial) (table 1).
Tukey’s test (P = 0.05) showed that
Pseudomonas mediterranea (21.6 mm)
had highest phosphorus solubilization,
followed by Bacillus aryabhattai (14.4
mm) (table 2).
Table 1. Analysis of variance of phosphorus solubilization test in
bacteria isolated from sugarcane rhizosphere in Tamaulipas
state, Mexico.
Cuadro 1. Análisis de varianza de la prueba de solubilización de fósforo
en bacterias aisladas de la rizósfera de la caña de azúcar en el
estado de Tamaulipas, México.
Variationsource Freedom degrees Squares sum Middle squares f calc. prob.
Treatments 125 134.75 8.93 5.84 0.0001**
Repetitions 3 2.71 0.90 0.59 0.624 ns
Time 1 1915.15 1915.15 1244.6 0.001**
Treat*Rep 45 668.38 14.85 9.65 0.001**
Time*Rep 15 1235.84 82.38 53.55 0.001**
Error 112 172.33 1.53
CV 12 %
CV= Coefcient of variation, ns= no signicance (P = 0.01).
CV = Coeciente de variación, ns = sin signicancia (P = 0,01).
This is important since phosphorus
is one of the essential macroelements
necessary for plant growth and
development, however, there is only
a small fraction of phosphorus in the
soil solution (1 ppm or 0.1 %) (Awais et
al., 2017). The phosphate-solubilizing
bacteria (PSB) have ability to
solubilize insoluble phosphorus and
make it available to plant roots for
la colonización de raíces, Iturin y
fengycin exhiben actividad antifúngica
contra una amplia gama de levaduras y
hongos lamentosos, juntos estimulan
una respuesta sistémica inducida
(ISR) en plantas hospedantes, por lo
que se consideran microorganismos
con potencial industrial y agrícola
(Lim et al., 2017).
Solubilización de fósforo. De
38 especies de bacterias detectadas,
solo se analizó un aislado por
especie para la solubilización de
fósforo, el resultado mostró que
menos del 50 % de las cepas pueden
solubilizar fósforo insoluble, el
mismo resultado fue reportado
por Mohammadi (2012), quien
observó una ecacia menor al 50
% en la solubilización del fósforo
insoluble. El análisis de varianza
fue altamente signicativo para el
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absorption (Awais et al., 2017), they
are predominately concentrated in
rhizosphere (Chen et al., 2006).
Table 2. Tukey’s means comparison (P = 0.05) of phosphorus solubilization
bacterial isolated from sugarcane rhizosphere.
Cuadro 2. Comparación de medias de Tukey (P = 0,05) de bacterias
solubilizadoras de fósforo aisladas de la rizosfera de la caña
de azúcar.
Number Treatments Average
T12 Pseudomonas mediterranea 21.6
a
± 1.38
T1 Bacillus aryabhattai 14.4
b
± 1.38
T2 Bacillus megaterium 14.1
b
± 1.38
T11 Pseudomonas koreensis 13.7
b
± 1.38
T14 Pseudomonas sp. 11.5
c
± 1.38
T13 Pseudomonas putida 11.1
c
± 1.38
T3 Bacillus mycoides 09.6
d
± 1.38
T7 Ensifer adhaerens 09.5
d
± 1.38
T4 Bacillus pumilus 09.0
e
± 1.38
T10 Paenibacillus illinoisensis 08.8
e
± 1.38
T6 Bacillus thuringensis 08.3
f
± 1.38
T5 Bacillus safensis 07.3
f
± 1.38
T9 Paenibacillus illinoisensis 07.3
f
± 1.38
T8 Paenibacillus barcinonensis 05.0
f
± 1.38
T15 Streptomyces venezuelae 03.8
h
± 1.38
T16 Terribacillus saccharophilus 03.3
h
± 1.38
a, b, c, d, e, f, g, h
Means with different letters are signicantly different (P = 0.05).
a, b, c, d, e, f, g, h
Medias con letras diferentes son signicativamente diferentes (P = 0,05).
In these analyses, 42% of
bacteria in sugarcane rhizosphere
have ability to solubilize insoluble
phosphorus, mainly Bacillus and
Pseudomonas genera, like that
observed by Mohammadi (2012), PSB
bacteria belong to genera Bacillus,
Pseudomonas, Rhizobium and
tiempo de solubilización del fósforo
(24, 48 y 72 h) y los tratamientos
(bacterianos) (cuadro 1).
La prueba de Tukey (P =
0,05) mostró que Pseudomonas
mediterranea (21,6 mm) tuvo la mayor
solubilización de fósforo, seguida
por Bacillus aryabhattai (14,4 mm)
(cuadro 2).
Esto es importante ya que el
fósforo es uno de los macroelementos
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Enterobacter, these bacteria can be
used as biofertilizers (de Santi Ferrara
et al., 2012). Biofertilizers represent
a sustainable solution to improve
plant growth, nutrition, root growth,
productivity, and response to stress
factors (Sharma et al., 2013; Anand et
al., 2016).
HPLC analysis. HPLC analysis
results showed that Bacillus
aryabhattai (6.0 ppm), Bacillus
safensis (50.9 ppm), Bacillus pumilus
(5.8 ppm) and Ensifer adhaerens
(5.6 ppm) had highest production
of 3-indoleacetic acid (IAA). These
results agree with those reported
by Lee et al. (2012), who reported
that Bacillus aryabhattai strain
LS15 generated highest production
IAA and Souza (2016) reported that
Ensifer adhaerens have ability to
x atmospheric nitrogen and IAA
production.
Different Rhizobacteria genera
have ability to produce and secrete
chemical compounds regulate and
promote plant growth (Ashraf et al.,
2011). IAA-producing bacteria have
longer survival and colonize plant
roots better than other bacteria
(Etesami et al., 2015), weakening the
plant defense mechanisms. In these
results, Bacillus genus had a great
capacity to produce IAA which may
be due to ability to release growth-
promoting substances and have a
better capacity for adaptation and
colonization of sugarcane rhizosphere
in soils of Tamaulipas state, such as
was observed by de Santi Ferrara et al.
(2012). Production of phytohormones,
such as auxins or gibberellins, is a
direct mechanism that is used by
esenciales necesarios para el
crecimiento y desarrollo de las plantas,
sin embargo, solo hay una pequeña
fracción de fósforo en la solución del
suelo (1 ppm o 0,1 %) (Awais et al.,
2017). Las bacterias solubilizadoras
de fosfato (PSB) tienen la capacidad
de solubilizar el fósforo insoluble y
ponerlo a disposición de las raíces
de las plantas para su absorción
(Awais et al., 2017), se concentran
predominantemente en la rizósfera
(Chen et al., 2006).
En estos análisis, el 42 % de
las bacterias en la rizósfera de la
caña de azúcar tienen capacidad
para solubilizar fósforo insoluble,
principalmente los géneros Bacillus
y Pseudomonas, como el observado
por Mohammadi (2012), las bacterias
PSB pertenecen a los géneros
Bacillus, Pseudomonas, Rhizobium y
Enterobacter, estas bacterias pueden
ser utilizados como biofertilizantes
(de Santi Ferrara et al., 2012). Los
biofertilizantes representan una
solución sostenible para mejorar
el crecimiento de las plantas, la
nutrición, el crecimiento de las raíces,
la productividad y la respuesta a los
factores de estrés (Sharma et al., 2013;
Anand et al., 2016).
Análisis por HPLC. Los
resultados del análisis de HPLC
mostraron que Bacillus aryabhattai
(6,0 ppm),
Bacillus safensis (50,9
ppm), Bacillus pumilus (5,8 ppm)
y Ensifer adhaerens (5,6 ppm)
tuvieron la mayor producción de ácido
3-indolacético (IAA). Estos resultados
concuerdan con los reportados por Lee
et al. (2012), quienes informaron que
la cepa LS15 de Bacillus aryabhattai
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PGR microorganisms. IAA is one of
the most physiologically active auxins
which controls many physiological
processes including stimulation of
cell division, cell elongation, cell
differentiation, light and gravitational
responses, and regulation of leaf fall
and fruit ripening (Massena and dos
Santos, 2015).
The bacterial evaluation under
greenhouse conditions, the chlorophyll
nitrogen amount in leaves and shoots
number per plant showed highly
signicant differences in ANOVA
analysis (table 3).
Tukey’s test (P = 0.05) showed
that Ensifer adhaerens and Bacillus
megaterium species presented
highest chlorophyll and nitrogen
averages in cultivar sugarcane CP
72-2086. Bacillus megaterium species
Table 3. Analysis of variance for amount of nitrogen, chlorophyll
and number of shoots traits in sugarcane cultivar CP 72-
2086 inoculated with bacteria isolated from rhizosphere of
sugarcane in Tamaulipas state, Mexico.
Cuadro 3. Análisis de varianza para las características cantidad de
nitrógeno, clorofila y número de brotes en el cultivar de caña
de azúcar CP 72-2086 inoculado con bacterias aisladas de la
rizósfera de la caña de azúcar en el estado de Tamaulipas,
México.
Variation
source
Chlorophyll
content
Nitrogen
content
Shoot
number
Treatments 2975.64
**
4045.72
**
0.0022
**
Repetitions 67.70
ns
0.588
ns
0.9052
ns
Error 35.00 15.46 0.0194
CV (%) 11.00 10.00 10.00
CV = Coefcient of variation; ns= no signicance (P = 0.01).
CV = coeciente de variación; ns = sin importancia (P = 0,01).
generó la mayor producción de IAA y
Souza (2016) informaron que Ensifer
adhaerens tiene la capacidad de jar
nitrógeno atmosférico y la producción
de IAA.
Los diferentes géneros de
Rhizobacteria tienen la capacidad
de producir y secretar compuestos
químicos que regulan y promueven el
crecimiento de las plantas (Ashraf et
al., 2011). Las bacterias productoras
de IAA tienen una supervivencia más
prolongada y colonizan las raíces de
las plantas mejor que otras bacterias
(Etesami et al., 2015), lo que debilita
los mecanismos de defensa de las
plantas. En estos resultados, el género
Bacillus tuvo una gran capacidad de
producir IAA lo cual puede deberse
a la capacidad de liberar sustancias
promotoras del crecimiento y tener
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presented two shoots per plant that
represented highest value, showing
signicant biostimulant behavior
(table 4). Situation that is presented
in the work of Cook et al. (2011), in pot
growth of sugarcane plants inoculated
with the species Pseudomonas luteola,
P. uorescens N50, Ochrobactrum
anthropi N208 and Stenotrophomonas
maltophilia 79 had the highest leaf
area indices and growth rates.
Table 4. Tukey’s means comparison (P = 0.05) of amount of nitrogen,
chlorophyll and number of shoots traits in sugarcane cultivar
CP 72-2086 inoculated with bacteria isolated from rhizosphere
of sugarcane in Tamaulipas state, Mexico.
Cuadro 4. Comparación de medias de Tukey (P = 0,05) para las
características de cantidad de nitrógeno, clorofila y número
de brotes en el cultivar de caña de azúcar CP 72-2086 inoculado
con bacterias aisladas de la rizosfera de la caña de azúcar en el
estado de Tamaulipas, México.
Number Treatments Chlorophyll content Nitrogen content Shoot number
T1 Bacillus aryabhattai 37.8
c
± 1.03 1.18
b
± 0.08 2
a
± 0.18
T2 Bacillus licheniformis 45.8
a
± 1.03 2.38
a
± 0.08 1
b
± 0.18
T3 Bacillus megaterium 48.0
a
± 1.03 2.53
a
± 0.08 2
a
± 0.18
T4 Bacillus pumilus 35.2
d
± 1.03 1.78
c
± 0.08 2
a
± 0.18
T5 Bacillus simplex 38.6
c
± 1.03 1.80
c
± 0.08 2
a
± 0.18
T6 Bacillus subtilis 43.6
b
± 1.03 2.30
a
± 0.08 1
b
± 0.18
T7 Bacillus safensis 44.9
b
± 1.03 2.37
a
± 0.08 1
b
± 0.18
T8 Ensifer adhaerens 48.1
a
± 1.03 2.50
a
± 0.08 1
b
± 0.18
T9 Pseudomonas 30.0
b
± 1.03 2.49
a
± 0.08 1
b
± 0.18
T10 Control 48.0
a
± 1.03 1.05
b
± 0.08 4
a
± 0.18
a, b, c, d
Means with different letters are signicantly different (P = 0.05).
a, b, c, d
Medias con letras diferentes son signicativamente diferentes (P = 0,05).
una mejor capacidad de adaptación
y colonización de la rizósfera de la
caña de azúcar en suelos del estado de
Tamaulipas, como lo observó de Santi
Ferrara et al. (2012). La producción
de tohormonas, como auxinas o
giberelinas, es un mecanismo directo
que utilizan los microorganismos
PGR. IAA es una de las auxinas más
siológicamente activas que controla
muchos procesos siológicos, incluida
Biological evaluations by
Castellanos-González
et al. (2016),
showed responses to biofertilization
with the combination of cachaça and
la estimulación de la división celular, el
alargamiento celular, la diferenciación
celular, las respuestas lumínicas y
gravitacionales y la regulación de la
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End of English Version
phosphate rock with commercial
biofertilizers EcoMic® and Azotofos®,
achieving increases in the number of
shoots in sugarcane seedlings. Gómez
et al. (2019), also with inoculation of
the biofertilizer NITROFIX® provoked
a stimulating response on the radical
growth of the evaluated varieties of
sugarcane.
Conclusions
The isolation and bacterial
identication by the 16S rRNA gene
of the rhizosphere of the sugarcane
variety CP 72-2086 cultivated in the
state of Tamaulipas, Mexico, identied
in greater proportion species of the
genus Bacillus.
The analysis of in vitro parameters
of dissolution of phosphorus and
IAA and the measured parameters
of the amount of chlorophyll,
nitrogen and shoots detected in the
greenhouse bacterial inoculation in
the sugarcane variety CP 72-2086,
indicated that Bacillus megaterium
and Ensifer adhaerens had the
highest performance, postulating
these isolates to future evaluations
in sugarcane cultivated in the state of
Tamaulipas, Mexico to evaluate their
effect as possible biofertilizers in the
production of sugarcane.
Acknowledgment
Conacyt-FOMIX-Tamaulipas:
Tamaulipas Key: 00000000019961,
and Instituto Politécnico Nacional.
caída de las hojas y la maduración del
fruto (Massena y dos Santos, 2015)
La evaluación bacteriana en
condiciones de invernadero, la
cantidad de nitrógeno clorofílico
en hojas y el número de brotes
por planta mostró diferencias
altamente signicativas en el
análisis ANAVAR (cuadro 3).
La prueba de Tukey (P = 0,05)
mostró que las especies de Ensifer
adhaerens y Bacillus megaterium
presentaron los promedios más
altos de clorola y nitrógeno en
el cultivar de caña de azúcar CP
72-2086. Las especies de Bacillus
megaterium presentaron dos brotes
por planta que representaron
el mayor valor, mostrando un
comportamiento bioestimulante
signicativo (cuadro 4). Situación
que se presenta en el trabajo de Cook
et al. (2011), en macetas de plantas
de caña de azúcar inoculadas con
las especies Pseudomonas luteola,
P. uorescens N50, Ochrobactrum
anthropi N208 y Stenotrophomonas
maltophilia 79 tuvieron los índices
de área foliar y tasas de crecimiento
más altos.
Evaluaciones biológicas de
Castellanos-González et al.
(2016), mostraron respuestas a la
biofertilización con la combinación
de cachaça y roca fosfórica con
biofertilizantes comerciales
EcoMic® y Azotofos®, logrando
incrementos en el número de brotes
en plántulas de caña de azúcar.
Gómez et al. (2019), también con
la inoculación del biofertilizante
NITROFIX® provocó una respuesta
estimulante sobre el crecimiento
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radical de las variedades evaluadas
de caña de azúcar.
Conclusiones
El aislamiento e identicación
bacteriana por el gen 16S rRNA de
la rizósfera de la variedad de caña
de azúcar CP 72-2086 cultivada en
el estado de Tamaulipas, México,
identicó en mayor proporción especies
del género Bacillus.
El análisis de los parámetros in
vitro de disolución de fósforo e IAA y los
parámetros medidos de la cantidad de
clorola, nitrógeno y brotes detectados
en la inoculación bacteriana en
invernadero en la variedad de caña de
azúcar CP 72-2086, indicó que Bacillus
megaterium y Ensifer adhaerens
presentaron los mayores niveles de
desempeño, postulando estos aislados
para futuras evaluaciones en caña
de azúcar cultivada en el estado de
Tamaulipas, México para evaluar su
efecto como posibles biofertilizantes en
la producción de caña de azúcar.
Agradecimiento
Conacyt-FOMIX-Tamaulipas:
Código Tamaulipas: 00000000019961,
e Instituto Politécnico Nacional.
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