913
Rev. Fac. Agron. (LUZ). 2021, 38(4): 913-933. Octubre-Diciembre.
DOI: https://doi.org/10.47280/RevFacAgron(LUZ).v38.n4.10 ISSN 2477-9407
Esta publicación científica en formato digital es continuación de la Revista Impresa: Depósito legal pp 196802ZU42, ISSN 0378-7818.
Recibido: 04-04-2021 . Aceptado: 08-06-2021.
*Autor de correspondencia. Correo electrónico:
mrojas@uabcs.mx
Bacterias con actividad antifúngica asociadas a
Ocimum basilicum L.
Ocimum basilicum L. associated bacteria with
antifungal activity
Ocimum basilicum L. bactérias associadas com atividade
antifúngica
Pablo Misael Arce-Amezquita
1
, Mirella Romero-Bastidas
2
y
Maurilia
Rojas-Contreras
3
*
Departamento Académico de Agronomía, Universidad Autónoma de Baja California Sur.
Carretera al sur km 5.5, Col. El Mezquitito. 23080, La Paz, Baja California Sur. México.
Correo electrónico: (PA) parce@uabcs.mx, , (MR) miromero@uabcs.mx, , (MRC)
mrojas@uabcs.mx, .
Resumen
La presencia de patógenos, como hongos, es una de las causas más importantes
de pérdida de cultivos de albahaca en todo el mundo; sin embargo, muchos
microorganismos tienen un papel crucial en el desarrollo de las plantas, incluida la
protección contra los patógenos. En el presente estudio, se aislaron, cuanticaron y
preservaron las bacterias predominantes asociadas a albahaca. La caracterización
de las bacterias aisladas mostró 165 cepas Gram positivas, 152 con morfología bacilar
y 13 con cocoide. Posteriormente, se realizaron ensayos de antagonismo in vitro,
primero en contra Aspergillus spp. y posteriormente en contra de Neoscytalidium
dimidiatum, Alternaria, spp. y Aspergillus spp. Finalmente, ensayos para evaluar
el efecto de las bacterias aisladas sobre la germinación de semillas y las primeras
etapas de desarrollo de albahaca fueron llevados cabo. Las plantas de albahaca
muestreadas, producidas alrededor de La Paz, Baja California Sur, México, fueron
colonizadas por bacterias antagonistas conocidas del género Bacillus. Las cepas
de Bacillus amyloliquefaciens fueron las que presentaron de forma predominante
la actividad antifúngica. Además, las cepas ALMH42, ALMR73 y ALAH91 no
mostraron ningún efecto deletéreo sobre el desarrollo de las plántulas de albahaca.
La exploración del potencial biotecnológico de estas cepas aisladas de plantas sanas
de albahaca es de gran interés para futuras aplicaciones en este y otros cultivos.
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Palabras clave: Bacillus spp., albahaca, Aspergillus spp., Neoscytalidium
dimidiatum, Alternaria spp., bacteria antifúngica.
Abstract
The presence of pathogens, like fungi, is one of the most important causes of basil
crop loss around the world; however, many microorganisms have a crucial role on
plant development including protection against pathogenic ones. In the present study,
basil associated bacteria were isolated, quantied and preserved. Characterization of
isolated bacteria showed 165 Gram positive strains, 152 with bacillary and 13 with
coccoid morphology. Later, in vitro antagonism assays were performed, rst against
Aspergillus spp. and then against Neoscytalidium dimidiatum, Alternaria spp. and
Aspergillus spp. Finally, the effect of the isolated bacteria on basil seed germination
and rst stages of development were carried out. Sampled basil plants, produced
around La Paz, Baja California Sur, Mexico, were colonized by known antagonistic
bacteria of the Bacillus genus. Bacillus amyloliquefaciens strains were the prevailing
species with antifungal activity. Moreover, strains ALMH42, ALMR73 and ALAH91
did not show any deleterious effect on basil seedling development. Biotechnological
potential exploration of these isolated strains from healthy basil plants is of great
interest for future applications on this and other crops.
Keywords: Bacillus spp., basil, Aspergillus spp., Neoscytalidium dimidiatum,
Alternaria spp., antifungal bacteria.
Resumo
A presença de patógenos, como fungos, é uma das causas mais importantes de
perda de lavouras de manjericão em todo o mundo; entretanto, muitos microrganismos
desempenham um papel crucial no desenvolvimento das plantas, incluindo proteção
contra patógenos. No presente estudo, as bactérias associadas ao manjericão
predominantes foram isoladas, quanticadas e preservadas. A caracterização das
bactérias isoladas mostrou 165 cepas Gram positivas, 152 com morfologia bacilar
e 13 com cocóide. Posteriormente, foram realizados testes de antagonismo in vitro,
primeiro contra Aspergillus spp. e mais tarde contra Neoscytalidium dimidiatum,
Alternaria, spp. e Aspergillus spp. Por m, foram realizados ensaios para avaliar o
efeito das bactérias isoladas na germinação das sementes e nos estágios iniciais do
desenvolvimento do manjericão. As plantas de manjericão amostradas, produzidas
em torno de La Paz, Baja California Sur, México, foram colonizadas por bactérias
antagonistas conhecidas do gênero Bacillus. As cepas de Bacillus amyloliquefaciens
foram aquelas que exibiram predominantemente atividade antifúngica. Além
disso, as cepas ALMH42, ALMR73 e ALAH91 não apresentaram efeito deletério no
desenvolvimento de mudas de manjericão. A exploração do potencial biotecnológico
dessas cepas isoladas de plantas saudáveis de manjericão é de grande interesse para
futuras aplicações nesta e em outras culturas.
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Palavras-chave: Bacillus spp., Manjericão, Aspergillus spp., Neoscytalidium
dimidiatum, Alternaria spp., Bactéria antifúngica.
Introducción
La sanidad y productividad de las
plantas están relacionadas con su
microbiota, dominada principalmente
por bacterias y hongos (Purahong et
al., 2018). Las interacciones entre
plantas y microorganismos han estado
presentes durante mucho tiempo en la
evolución, ya que los microorganismos
han ayudado a las plantas a lidiar
con la falta de nutrientes, condiciones
estresantes y patógenos (Smith et
al., 2015). El estudio de las bacterias
asociadas a las plantas, su potencial
antagonista en el control de patógenos
y su efecto como promotores del
crecimiento comprende la acción de
varios géneros y especies de bacterias
que pueden aislarse de la supercie de
los tejidos vegetales u obtenerse del
interior de la planta (Daungfu et al.,
2019). En México y en muchas otras
partes del mundo, la albahaca (Ocimum
basilicum L., Fam. Lamiaceae) es
una hierba aromática de importancia
económica. En Baja California Sur,
México, la producción de albahaca
dulce fue de aproximadamente 1.685
toneladas al nal del ciclo 2019 (SIAP
2019). La variedad Nuffar fue la
principal albahaca dulce cultivada en
el estado. Esta planta se utiliza en la
industria alimentaria y en la medicina
tradicional (Gilardi et al., 2013). Las
plantas de albahaca albergan una
microbiota distintiva responsable del
crecimiento, la calidad y la salud a
través del metabolismo microbiano y
las interacciones con el hospedador
Introduction
Plant’s health and productivity
have been linked to their microbiota
dominated mainly by bacteria
and fungi (Purahong et al., 2018).
Interactions between plants and
microorganism have been present
for a long time in evolution, since
microorganisms have helped plants to
deal with lack of nutrients, stressful
conditions, and pathogens (Smith et al.,
2015). The study of plant-associated
bacteria, their antagonistic potential
in control of pathogens and their effect
as growth promoters comprise the
action of several genera and species of
bacteria that can be isolated from the
surface of plant tissues or obtained
from within the plant (Daungfu et
al., 2019). In Mexico, and many other
parts of the world, basil (Ocimum
basilicum L., Fam. Lamiaceae) is
an economically important aromatic
herb. In Baja California Sur, Mexico,
production of sweet basil was
approximately 1,685 tons at the end
of 2019 cycle (SIAP 2019). Nuffar
variety was the main sweet basil
grown in the state. This plant is used
in the food industry and in traditional
medicine (Gilardi et al., 2013). Basil
plants shelter a distinctive microbiota
responsible for growth, quality and
health via microbial metabolism
and host interactions (Adamović
et al., 2015). However, successive
cultivation in the same soil for a
long time is known to be associated
with changes in physicochemical
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(Adamović et al., 2015). Sin embargo,
se sabe que el cultivo sucesivo en
el mismo suelo durante mucho
tiempo está asociado con cambios en
las propiedades sicoquímicas del
suelo, lo que a su vez, proporciona
condiciones que causan enfermedades
por patógenos, lo que lleva a pérdidas
devastadoras de rendimiento. En
este estudio, el objetivo fue aislar
e identicar bacterias asociadas a
plantas sanas de albahaca de cultivos
alrededor de La Paz, Baja California
Sur, México, con la capacidad de
inhibir el desarrollo de hongos
patógenos sin afectar el desarrollo de
las plántulas.
Materiales y métodos
Material vegetal y sitio
experimental
Se tomaron muestras de plantas de
albahaca de cultivos con condiciones
agroecológicas similares dentro
del área de La Paz, B.C.S. México.
Se seleccionaron aleatoriamente
por cultivo tres plantas adultas de
albahaca, listas para la cosecha,
aparentemente sanas, con partes
aéreas intactas (hojas normales sin
manchas ni alteraciones de color),
tallos sin deformaciones, separadas
al menos 50 metros entre sí. Las
ubicaciones de los cultivos fueron:
Pescadero (Pradera Escolar 23°
21´56”N, 110°10´27”O y Las Maravillas
23°21´43”N, 110°11´18”O), Todos
Santos (Sueño Tropical 23°31´29”N,
110°17´15”O) y Los Planes (Cesar
Cárdenas, 23°57´11”N, 109°55´50”O).
La raíz, el tallo y las hojas de cada
planta se separaron y se colocaron
properties of the ground, which in
turn, provides conditions that cause
diseases by pathogens, leading to
devastating yield losses. In this
study, the objective was to isolate and
identify bacteria associated to healthy
basil plants from crops around La
Paz, Baja California Sur, Mexico,
with the ability to inhibit pathogenic
fungi development without affecting
seedling development.
Material and methods
Plant material and
experimental site
Samples of basil plants were
taken from crops with similar
agroecological conditions within the
area of La Paz, B.C.S. México. Three
adult basil plants, ready for harvest,
apparently healthy, with intact aerial
parts (normal leaves without spots
or color alterations), stems without
deformations, separated at least 50
meters one from each other, were
randomly selected per crop. The crop
locations were: Pescadero (Pradera
Escolar 23°21´56”N, 110°10´27”W
and Las Maravillas 23°21´43”N,
110°11´18”W), Todos Santos (Sueño
Tropical 23°31´29”N, 110°17´15”W)
and Los Planes (Cesar Cárdenas,
23°57´11”N, 109°55´50”W). Root,
stem and leaves of each plant were
separated and placed in sterile
plastic bags. Later, the samples were
transported to the Laboratory where
the microbiological analysis was
carried out.
Isolation of bacteria
To isolate predominant bacteria,
two culture media were used. Standard
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en bolsas de plástico estériles.
Posteriormente, las muestras fueron
transportadas al Laboratorio donde se
realizó el análisis microbiológico.
Aislamiento de bacterias
Para aislar las bacterias
predominantes, se utilizaron dos
medios de cultivo. Se utilizó agar para
métodos estándar o agar de recuento
en placa (SMA, DIFCO) para aislar
las bacterias y se utilizó agar de Man
Rogosa y Sharp (MRS, DIFCO) para
aislar las bacterias del ácido láctico.
Brevemente, se colocaron 10 g de
raíz, tallo u hojas en 90 ml de solución
salina tampón fosfato (PBS) (NaCl
145 mM, KH
2
PO
4
2,87 mM y K
2
HPO
4
6,95 mM, pH 7,2) y se trituraron
con un homogeneizador de tejidos
(Ultra-Turrax T25, Janke & Kunkel)
hasta obtener una suspensión. Se
prepararon diluciones en serie y luego
se extendieron 100 µl de cada dilución
en placas de Petri duplicadas que
contenían: SMA y MRS, las placas se
incubaron a 35 °C durante 24 h. Las
bacterias de colonias predominantes
y morfológicamente diferentes se
cruzaron y puricaron en placas que
contenían el mismo medio que la
placa en la que crecieron primero. Las
bacterias se caracterizaron mediante
tinción de Gram y morfología celular
bajo un microscopio de contraste de
fase (Nikon Eclipse E-600), luego se
inocularon en caldo de soya tríptico
(TSB, DIFCO), se incubaron durante
la noche a la temperatura anterior y
se conservaron con glicerol al 50 % a
-80 ºC. (Goldman y Green 2009). Las
bacterias aisladas se etiquetaron de
la siguiente manera: las dos primeras
letras corresponden a la planta
methods agar or plate count agar
(SMA, DIFCO) was used to isolate
bacteria and de Man Rogosa and
Sharp agar (MRS, DIFCO) was used
to isolate lactic acid bacteria. Briey,
10 g of root, stem or leaves were
placed into 90 mL of phosphate buffer
saline (PBS) (145 mM NaCl, 2.87
mM KH
2
PO
4
and 6.95 mM K
2
HPO
4
,
pH 7.2) and triturated with a tissue
homogenizer (Ultra-Turrax T25,
Janke & Kunkel) until a suspension
was obtained. Serial dilutions were
prepared and then 100 µL of each
dilution was spread on duplicated
Petri dishes containing: SMA and
MRS, the plates were incubated at 35
°C for 24 h. Bacteria from predominant
and morphologically different colonies
were cross streaked and puried onto
plates containing the same media
as the plate they grew rst. Bacteria
were characterized by Gram staining
and cell morphology under a phase
contrast microscope (Nikon Eclipse
E-600), then inoculated in Tryptic Soy
Broth (TSB, DIFCO) and incubated
overnight at the above temperature
and preserved with 50 % glycerol at
-80 ºC (Goldman and Green 2009).
The isolated bacteria were labeled as
follows: rst two letters correspond
to the investigated plant, in this case
AL for basil; third letter corresponds
to culture media they were isolated
from, A for standard methods agar
and M for de Man Rogosa and Sharpe
medium. Fourth letter corresponds to
the part of the plant sampled: R for
root, T for stem and H for leaves. First
number corresponds to the sampling
area: 1-3 corresponds to Pescadero,
4-6 corresponds to Los Planes and 7-9
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investigada, en este caso AL para
albahaca; La tercera letra corresponde
al medio de cultivo del que se aislaron,
A para los métodos estándar de agar
y M para el medio de Man Rogosa y
Sharpe. La cuarta letra corresponde
a la parte de la planta muestreada:
R para raíz, T para tallo y H para
hojas. El primer número corresponde
al área de muestreo: 1-3 corresponde
a Pescadero, 4-6 corresponde a Los
Planes y 7-9 corresponde a Todos
Santos. Finalmente, el último número
corresponde a la colonia aislada.
Hongos modelo utilizados en
ensayo antagonista
Los hongos utilizados en este estudio
fueron Aspergillus spp., Alternaria
spp. y Hendersonula spp. actualmente
identicado como Neoscytalidium
dimidiatum. Aspergillus spp.
proviene de un cultivo monospórico
aislado de suelo y caracterizado por
su morfología colonial (macroscópica)
y celular (microscópica) según
claves taxonómicas generales en el
Laboratorio de Ciencia y Tecnología de
Alimentos de esta Universidad. Este
hongo se utilizó en esta investigación
como modelo para realizar el primer
cribado de bacterias con capacidad
antagonista. Alternaria spp. y N.
dimidiatum también provienen de
un cultivo monospórico y fueron
previamente aislados de Ocimum
basilicum L. y Ficus benjamina
respectivamente (Hernández-Montiel
et al., 2018). Estos hongos se utilizaron
como modelo para importantes
patógenos vegetales en esta región.
Ensayo antifúngico cualitativo
La actividad antifúngica se
detectó mediante una metodología
corresponds to Todos Santos. Finally,
the last number corresponds to the
isolated colony.
Model Fungi used in
antagonistic assay
The fungi used in this study were
Aspergillus spp., Alternaria spp.
and Hendersonula spp. currently
identied as Neoscytalidium
dimidiatum. Aspergillus spp. comes
from a monosporic culture isolated
from soil and characterized by its
colonial (macroscopic) and cellular
(microscopic) morphology according
to general taxonomic keys in the
Laboratorio de Ciencia y Tecnología
de Alimentos at this University. This
fungus was used in this research as a
model to carry out the rst screening
of bacteria with antagonistic capacity.
Alternaria spp. and N. dimidiatum
also come from a monosporic culture
and were previously isolated from
Ocimum basilicum L. and Ficus
benjamina respectively (Hernández-
Montiel et al., 2018). These fungi were
used as a model for important plant
pathogens in this region.
Qualitative antifungal assay
The antifungal activity was
detected using a methodology
developed by our research group.
The confrontation assays against
Aspergillus spp. were carried out in
a method previously described (Joo et
al., 2015), modied with dual culture
plates containing a mixture of TSA
and PDA at 1:1 ratio. The isolated and
puried bacteria were inoculated at
1 % in TSB and incubated overnight
at 30 ºC, then 10 µL drop of the
suspension was placed on each Petri
dish at 15 mm away from the edge.
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desarrollada por nuestro grupo
de investigación. Los ensayos de
confrontación contra Aspergillus spp.
se llevaron a cabo mediante un método
previamente descrito (Joo et al., 2015),
modicado con placas de cultivo dual
conteniendo una mezcla de TSA y
PDA en proporción 1: 1. Las bacterias
aisladas y puricadas se inocularon al
1 % en TSB y se incubaron durante la
noche a 30 ºC, luego se colocaron gotas
de 10 µL de la suspensión en cada
placa de Petri a 15 mm del borde. Las
placas se incubaron durante 24 ha 30
ºC. Posteriormente, se impregnó un
disco de papel de ltro de 4 mm de
diámetro, humedecido con PBS, con
esporas de Aspergillus spp. colonia
cultivada durante 72 h a 30 ºC en
medio PDA, y luego colocada a 15 mm
de la colonia de bacterias. Los cultivos
duales, realizados por duplicado, se
incubaron durante 72 h a 30 ºC y luego
se observaron las zonas de inhibición.
Se utilizó como control positivo una
placa de Petri inoculada únicamente
con el disco que contenía el hongo.
Ensayo antimicótico confirma-
torio
El crecimiento de las bacterias
que mostraron claramente una zona
de inhibición de Aspergillus spp.
se probó contra Aspergillus spp.,
N. dimidiatum y Alternaria spp.
utilizando la metodología desarrollada
por nuestro grupo de investigación.
Las cepas bacterianas reactivadas en
TSB se inocularon al 1 % en tubos con
el mismo medio y se incubaron durante
24 ha 30 ºC. Posteriormente, se
centrifugaron a 3.500 rpm, se decantó
el sobrenadante y se resuspendieron
los sedimentos en el mismo volumen
The dishes were incubated for 24 h at
30 ºC. Subsequently, a 4 mm diameter
lter paper disk, moistened with PBS
was impregnated with spores of an
Aspergillus spp. colony grown for 72
h at 30 ºC in PDA medium, and then
placed 15 mm away from the bacteria
colony. The dual cultures, performed
in duplicate, were incubated for 72
h at 30 ºC and then inhibition zones
were observed. A Petri dish inoculated
only with the disc containing the
fungus was used as positive control.
Confirmatory antifungal assay
The growth of bacteria that
clearly showed an inhibition zone of
Aspergillus spp. were tested against
Aspergillus spp., N. dimidiatum and
Alternaria spp. using methodology
developed by our research group.
Bacterial strains reactivated in TSB
were inoculated at 1 % in tubes with
the same medium and incubated for
24 h at 30 ºC. Subsequently, they
were centrifuged at 3,500 rpm, the
supernatant was decanted, and the
pellets were resuspended in the
same volume of PBS. Parallelly, the
fungi were cultivated in PDA for 72
h, its spores were collected, and its
concentration was adjusted to 10
6
spores mL
-1
by direct count, under
the microscope using a Neubauer
plate. Then, 0.1 mL of the suspensions
were spread onto TSA-PDA 1:1 Petri
dishes. Later three 10 μL drops of
each bacterial suspension were evenly
distributed on the plate previously
spread with a fungus. The plates
were then incubated at 30 ºC for 72
h. After the incubation time, the
zone of inhibition was measured in
millimeters. Two replicates were made
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de PBS. Paralelamente, los hongos
se cultivaron en PDA durante 72
h, se recolectaron sus esporas y
se ajustó su concentración a 106
esporas mL
-1
por conteo directo, bajo
el microscopio utilizando una placa
Neubauer. Luego, se esparcieron 0,1
ml de las suspensiones sobre placas
Petri TSA-PDA 1:1. Posteriormente
se distribuyeron uniformemente
tres gotas de 10 μL de cada
suspensión bacteriana sobre la
placa previamente esparcida con un
hongo. A continuación, las placas
se incubaron a 30 ºC durante 72 h.
Después del tiempo de incubación,
se midió la zona de inhibición en
milímetros. Se realizaron dos réplicas
por tratamiento y el experimento
se repitió dos veces. Se midieron las
zonas de inhibición y se seleccionaron
bacterias con grandes zonas de
inhibición (más de 10 mm) para la
identicación molecular.
Identificación molecular
Las bacterias se identicaron
mediante secuenciación del gen 16S
rDNA. El ADN total se extrajo siguiendo
las recomendaciones de los fabricantes
(Wizard® Genomic DNA Purication
Kit, Promega Corporation). La
PCR se llevó a cabo utilizando
cebadores universales pA (directo):
5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’
y pH (inverso):
5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’
siguiendo el método de Broda et al.
(1999). Los amplicones se puricaron
y luego se secuenciaron. Los datos
obtenidos se procesaron mediante
búsquedas BLAST en el NCBI y
se cargaron en la base de datos de
GenBank.
per treatment and the experiment
was repeated twice. Inhibition zones
were measured and bacteria with
large inhibition zones (more than
10 mm) were selected for molecular
identication.
Molecular identification
Bacteria were identied by 16S
rDNA gene sequencing. Total DNA was
extracted following manufacturers
recommendation (Wizard® Genomic
DNA Purication Kit, Promega
Corporation). PCR was carried out
using universal primers pA (forward):
5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’
and pH (reverse):
5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’
following Broda et al. (1999) method.
The amplicons were puried and then
sequenced. The obtained data was
processed using BLAST searches in
the NCBI and uploaded to GenBank
database.
Germination test
Microtubes were lled with one
hundred twenty basil seeds. The
seeds were disinfected with a 4.25 %
aqueous sodium hypochlorite solution
for 2 minutes, rinsed with sterile
distilled water three times. Then seeds
were inoculated with the suspension
of bacteria that presented antifungal
activity against Aspergillus spp.
containing 10
6
CFU.mL
-1
and let stand
for two minutes. The supernatant was
decanted, and the seeds were set in
a completely random design which
consisted of four replicates of 30 seeds
per treatment and controls. The seeds
were placed in Petri dishes with a
lter paper covering the bottom of the
plate. Water was added to moisten the
seeds and then let stand for 5 days in
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Prueba de germinación
Los microtubos se llenaron con ciento
veinte semillas de albahaca. Las semillas
se desinfectaron con una solución acuosa
de hipoclorito de sodio al 4,25 % durante 2
minutos, se enjuagaron con agua destilada
estéril tres veces. Luego se inocularon
semillas con la suspensión de bacterias
que presentaban actividad antifúngica
contra Aspergillus spp. que contiene 106
CFU.mL
-1
y se dejó reposar durante dos
minutos. Se decantó el sobrenadante
y las semillas se distribuyeron en un
diseño completamente aleatorio que
consistió en cuatro repeticiones de 30
semillas por tratamiento y controles.
Las semillas se colocaron en placas de
Petri con un papel de ltro que cubría el
fondo de la placa. Se añadió agua para
humedecer las semillas y luego se dejó
reposar durante 5 días en la oscuridad
en una cámara de germinación a 25 °C.
La rotura de la testa se consideró como
indicación de germinación. Las plántulas
de cinco días se separaron mediante
hipocótilo y radícula, la longitud de todas
las plántulas se midió con el software
RootNav (Pound et al., 2013), luego se
secaron y pesaron para obtener biomasa
seca. La signicancia de los resultados
obtenidos se analizó mediante análisis
de varianza univariante (ANOVA), se
utilizó como factor jo la inoculación
de semillas con diferentes bacterias.
La diferencia entre las medias se
determinó mediante la prueba de Tukey
de rango múltiple HSD en p = 0,05.
Los valores medios se consideraron
signicativamente diferentes cuando
p≤ 0,05. El análisis estadístico se llevó
a cabo utilizando el software SAS
(Statistical Analysis System (SAS), SAS
University Edition).
the dark in a germination chamber at
25 °C. Testa rupture was considered
as indication of germination. Five
days old seedlings were separated
out by hypocotyl and radicle, length
of all seedlings was measured by
the software RootNav (Pound et al.,
2013), then dried and weighted to
obtain dry biomass. The signicance
of the obtained results was analyzed
by one-way univariate analysis of
variance (ANOVA), seed inoculation
with different bacteria was used as a
xed factor. The difference between
the means was determined by Tukey´s
test HSD multiple range test at p=
0.05. Mean values were considered
signicantly different when p≤ 0.05.
Statistical analysis was carried
out using SAS software (Statistical
Analysis System (SAS) software, SAS
University Edition).
Results and discussion
The microbiological status
of healthy basil plants should
be determined by the growing
conditions, the environment of the
region, the method of cultivation and
the associated benecial microbiota
at any stage of their production
process. In this study a total of 165
isolates were obtained from the
predominant microbiota of different
parts of the sampled apparently
healthy basil plants from different
sites. Ninety-four isolates were from
SMA and 71 from MRS media used
in the microbiological analysis, all
of them were Gram positive, 152
with bacillary and 13 with coccoid
morphology.
922
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Resultados y discusión
El estado microbiológico de las
plantas de albahaca sanas debe estar
determinado por las condiciones de
crecimiento, el medio ambiente de
la región, el método de cultivo y la
microbiota beneciosa asociada en
cualquier etapa de su proceso de
producción. En este estudio se obtuvo un
total de 165 aislamientos de la microbiota
predominante de diferentes partes de
las plantas de albahaca aparentemente
sanas muestreadas en diferentes sitios.
Noventa y cuatro aislamientos fueron
de SMA y 71 de medios MRS utilizados
en el análisis microbiológico, todos
fueron grampositivos, 152 con morfología
bacilar y 13 con morfología cocoide.
Entre las bacterias colonizadoras de
plantas más comunes se encuentran
las del género Bacillus (Moffat, 2001).
Se sabe que la resistencia sistémica
inducida es desencadenada por
miembros beneciosos del microbioma de
la raíz en una amplia gama de plantas
hospedantes, lo que las hace resistentes
contra diversas amenazas patógenas.
Esta mejora sistémica también se
ha descrito para muchas bacterias
promotoras del crecimiento de plantas del
género Bacillus (Pieterse et al., 2014). Es
bien sabido que las bacterias del género
Bacillus tienen la capacidad de producir
una serie de compuestos bioactivos con
actividad antimicrobiana (Raaijmakers,
2010).
El ensayo de confrontación
cualitativa de 165 aislamientos contra
Aspergillus spp. resultó en 15 cepas de
bacilos que inhibieron el crecimiento
del hongo en diferentes grados (gura
1). Se aislaron cepas antagonistas de la
Among the most common plant
colonizing bacteria, we can nd those
of the Bacillus genus (Moffat, 2001).
It is known that induced systemic
resistance is triggered by benecial
members of the root microbiome in a
wide range of plant hosts making them
resistant against various pathogenic
threats. This systemic enhancement
has also been described for many
plant growth-promoting bacteria of
the Bacillus genus (Pieterse et al.,
2014). It is well known that bacteria of
the Bacillus genus have the capability
of producing a series of bioactive
compounds with antimicrobial activity
(Raaijmakers, 2010).
The qualitative confrontation
ass
ay of the 165 isolates against
Aspergillus spp. resulted in 15 bacilli
strains that inhibited the growth of
the fungus at different degrees (gure
1). Antagonistic strains were isolated
from aerial part of plants collected
in the towns of Los Planes and Todos
Santos. It is known that conditions on
the plant leaves and stem (aerial part)
are harsh for bacteria resulting in local
microsites at which conditions are
favorable for growth and/or survival
(Jacobs et al., 2005).
The conrmative confrontation
assay against Aspergillus spp., N.
dimidiatum and Alternaria spp.,
performed with the fteen bacterial
strains that showed antagonistic
activity, conrmed the grow
inhibition of fungi by some of them.
Bacterial strains presented non
regular inhibition zones on fungi
growth; therefore, length and width
measurements of the inhibition area
were documented (table 1). This
923
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parte aérea de plantas recolectadas en
las localidades de Los Planes y Todos
Santos. Se sabe que las condiciones en
las hojas y el tallo de la planta (parte
aérea) son adversas para las bacterias,
lo que da como resultado micrositios
locales en los que las condiciones son
favorables para el crecimiento y/o la
supervivencia (Jacobs et al., 2005).
Figura 1. Ensayo cualitativo de bacterias aisladas con actividad
antagonista frente a Aspergillus spp. en placas de Petri TSA-
PDA 50/50 después de una incubación de 72 h a 30 ºC.
Figure 1. Qualitative test of isolated bacteria with antagonistic activity
against Aspergillus spp. on TSA-PDA 50/50 Petri dishes after
incubation for 72 h at 30 ºC.
El ensayo de confrontación
conrmativa contra Aspergillus
spp., N. dimidiatum y Alternaria
spp., realizado con las quince
cepas bacterianas que mostraron
actividad antagonista, conrmó
la inhibición del crecimiento de
hongos por algunas de ellas. Las
cepas bacterianas presentaron
zonas de inhibición no regulares
sobre el crecimiento de hongos;
por lo tanto, se documentaron
las medidas de largo y ancho del
área de inhibición (cuadro 1).
Este comportamiento se observó
porque algunas bacterias son muy
móviles.
behavior was observed because some
bacteria are highly mobile.
Results of the molecular
identication of bacteria with
conrmed antifungal activity, showed
that all of them belong to the Bacillus
genus according to BLAST similarity
analysis (table 2). Bacillus isolates
like B. subtilis, B. methylotrophicus
and B. amyloliquefaciens have been
shown to have antagonistic activity
against common plant pathogenic
fungi. These bacteria species have
been considered efcient colonizers
that are widely spread due to their
capacity to form spores, to grow in
a wide range of temperatures and
to produce antibiotic compounds
that inhibit phytopathogens growth,
besides being plant growth promoters
(Rios-Velasco et al., 2016).
In this investigation eight strains
with antifungal activity against
Aspergillus spp., N. dimidiatum
and/or Alternaria spp., found in the
samples obtained from basil plants,
924
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Los resultados de la identicación
molecular de bacterias con actividad
antifúngica conrmada, mostraron
que todas ellas pertenecen al
género Bacillus según el análisis de
similitud BLAST (cuadro 2). Se ha
demostrado que aislados de Bacillus
como B. subtilis, B. methylotrophicus
y B. amyloliquefaciens tienen
actividad antagonista contra hongos
patógenos de plantas comunes.
Estas especies de bacterias han sido
consideradas colonizadoras ecientes
y ampliamente diseminadas debido
a su capacidad para formar esporas,
crecer en un amplio rango de
temperaturas y producir compuestos
antibióticos que inhiben el crecimiento
de topatógenos, además de ser
promotores del crecimiento vegetal
(Rios-Velasco et al., 2016).
Cuadro 1. Aspergillus spp., N. dimidiatum y Alternaria spp. zonas de
inhibición del crecimiento generadas por cepas bacterianas
con actividad antifúngica confirmada.
Table 1. Aspergillus spp., N. dimidiatum and Alternaria spp. growth
inhibition zones generated by bacterial strains with confirmed
antifungal activity.
Aspergillus spp.
N. dimidiatum
Alternaria spp.
Strain ID
Length
inhibition
zone (mm)
Width inhi-
bition zone
(mm)
Length
inhibition
zone (mm)
Width
inhibition
zone (mm)
Length
inhibition
zone (mm)
Width
inhibition
zone (mm)
ALMH42 < 10 < 10 28 28 < 10 < 10
ALMR73 < 10 < 10 < 10 < 10 31 25
ALMT73 23 18 30 31 28 26
ALAH71 < 10 < 10 < 10 < 10 30 31
ALAT82 < 10 < 10 < 10 < 10 30 26
ALAT81 < 10 < 10 30 26 28 24
ALAH91 < 10 < 10 30 30 < 10 < 10
ALAT75 < 10 < 10 23 27 < 10 < 10
were identied and six of them belong
to B. amyloliquefaciens. This is a
microorganism that grows mainly in
the rhizosphere, it begins to grow
close to the formation point of lateral
roots and it spreads on the root surface
(Lugtenberg and Kamilova, 2005).
Nowadays, it has been demonstrated
that inoculation of crops with B.
amyloliquefaciens strains could
increase production under stressful
conditions like nutrient limitations
or high salinity levels (Kim et al.,
2017). It also has been observed
that it could help to control other
pathogens either by competing for
nutrients or by producing antibiotics
and lytic enzymes; particularly, the
molecular basis of its plant growth-
promoting activity is mainly based
on the production of secondary
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En esta investigación se
id
enticaron ocho cepas con actividad
antifúngica contra Aspergillus spp.,
N. dimidiatum y/o Alternaria spp.,
encontradas en las muestras obtenidas
de plantas de albahaca, y seis de ellas
pertenecen a B. amyloliquefaciens.
Este es un microorganismo que
crece principalmente en la rizosfera,
comienza a crecer cerca del punto de
formación de las raíces laterales y se
disemina sobre la supercie de la raíz
(Lugtenberg y Kamilova, 2005). En la
actualidad, se ha demostrado que la
Cuadro 2. Identificación molecular de bacterias aisladas de plantas de
albahaca aparentemente sanas que presentaron actividad
antifúngica.
Table 2. Molecular identification of isolated bacteria from apparently
healthy plants of basil which present antifungal activity.
Isolated
strain
Molecular identication Place of origin
Part of the
plant
Access #
GenBank
ALMH42 Bacillus amyloliquefaciens
Cesar Cárdenas,
Los Planes
Leaves MT940837
ALMR73 Bacillus amyloliquefaciens
Sueño Tropical,
Todos Santos
Root MT940838
ALMT73 Bacillus amyloliquefaciens
Sueño Tropical,
Todos Santos
Stem MT940839
ALAH71 Bacillus amyloliquefaciens
Sueño Tropical,
Todos Santos
Leaves MT940840
ALAT82 Bacillus velezensis
Sueño Tropical,
Todos Santos
Stem MT940841
ALAT81 Bacillus amyloliquefaciens
Sueño Tropical,
Todos Santos
Stem MT940848
ALAH91 Bacillus amyloliquefaciens
Sueño Tropical,
Todos Santos
Leaves MT940842
ALAT75 Bacillus subtilis
Sueño Tropical,
Todos Santos
Stem MT940843
metabolites suppressing competitive
microbial pathogens occurring in the
plant rhizosphere, secretion of the
plant growth hormone auxin and the
synthesis of volatiles stimulating
plant growth and induced systemic
resistance (Chen et al., 2009). In
addition, some B. amyloliquefaciens
strains could decrease the incidence
of nematodes in some cultivars (Liu
et al., 2013). Other species found with
antagonistic activity against fungi were
B. velezensis and B. subtilis, members
of the Bacillus genus as well and
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inoculación de cultivos con cepas de B.
amyloliquefaciens podría aumentar la
producción en condiciones estresantes
como limitaciones de nutrientes o
altos niveles de salinidad (Kim et
al., 2017). También se ha observado
que podría ayudar a controlar otros
patógenos, ya sea compitiendo por los
nutrientes o produciendo antibióticos
y enzimas líticas; particularmente,
la base molecular de su actividad
promotora del crecimiento vegetal se
basa principalmente en la producción
de metabolitos secundarios que
suprimen los patógenos microbianos
competitivos que se encuentran en la
rizosfera de las plantas, la secreción
de la hormona del crecimiento vegetal
auxina y la síntesis de volátiles
que estimulan el crecimiento
de las plantas y la resistencia
sistémica inducida (Chen et al.,
2009). Además, algunas cepas de B.
amyloliquefaciens podrían disminuir
la incidencia de nematodos en algunos
cultivares (Liu et al., 2013). Otras
especies encontradas con actividad
antagonista contra los hongos fueron
B. velezensis y B. subtilis, miembros
del género Bacillus también y
estrechamente relacionados con B.
amyloliquefaciens (Rabbee et al.,
2019). Además, se ha demostrado
que la colonización microbiana tiene
un impacto importante en la calidad
de la albahaca dulce, especialmente
en la acumulación de importantes
metabolitos secundarios como el
aceite esencial (Banchio et al., 2009).
Esta capacidad excepcional es de
gran importancia cuando interesa
la producción de productos de alta
calidad.
closely related to B. amyloliquefaciens
(Rabbee et al., 2019). Also, it has been
shown that microbial colonization has
an important impact on sweet basil
quality, especially on accumulation
of important secondary metabolites
like essential oil (Banchio et al., 2009).
This outstanding ability is of great
importance when production of high-
quality products is of interest.
Strains with observed antagonistic
effect against Aspergillus spp. were
used in a germination experiment to
determine the effect of the bacteria on
total germination, length, and biomass
production of basil seedlings. The total
seed germination reached between 80
and 90 %. Figure 2 shows that all tested
bacteria had no signicant difference
on total germination of basil seeds as
compared to the control. Other reports
regarding Capsicum annuum seed
treatment with B. amyloliquefaciens
resulted in maximum enhancement of
seed germination (84.75 %), seedling
vigor (1,423.8) along with an increase
in vegetative growth parameters
(Gowtham et al., 2018). Recently, a
culture-independent next-generation
sequencing-based approach was
applied to investigate the benecial
impact of B. amyloliquefaciens L-S60
on the composition and dynamics of
rhizosphere microbiota, and growth
conditions of cucumbers during
plug seedling. Application of L-S60
signicantly altered the structure of
the bacterial community associated
with the cucumber seedling. Presence
of benecial rhizosphere species
such as Bacillus, Rhodanobacter,
Paenibacillus, Pseudomonas,
Nonomuraea, and Agrobacterium was
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Cepas con efecto antagonista
observado contra Aspergillus spp.
se utilizaron en un experimento de
germinación para determinar el efecto
de las bacterias sobre la germinación
total, la longitud y la producción
de biomasa de las plántulas de
albahaca. La germinación total
de la semilla alcanzó entre el 80 y
el 90 %. La Figura 2 muestra que
todas las bacterias probadas no
presentaron diferencias signicativas
en la germinación total de semillas
de albahaca en comparación con
el control. Otros informes sobre el
tratamiento de semillas de Capsicum
annuum con B. amyloliquefaciens
dieron como resultado un aumento
máximo de la germinación de las
semillas (84,75 %), el vigor de las
plántulas (1.423,8) junto con un
aumento de los parámetros de
crecimiento vegetativo (Gowtham et
al., 2018). Recientemente, se aplicó
un enfoque basado en secuenciación
de próxima generación independiente
del cultivo para investigar el impacto
benecioso de B. amyloliquefaciens
L-S60 en la composición y dinámica
de la microbiota de la rizosfera y
las condiciones de crecimiento de
los pepinos durante la plántula en
cepellón. La aplicación de L-S60 alteró
signicativamente la estructura de la
comunidad bacteriana asociada con
la plántula de pepino. La presencia de
especies beneciosas de la rizosfera
como Bacillus, Rhodanobacter,
Paenibacillus, Pseudomonas,
Nonomuraea y Agrobacterium fue
mayor con el tratamiento con L-S60
que en el grupo control (Qin et al.,
2017).
higher upon L-S60 treatment than in
the control group (Qin et al., 2017).
Likewise, hypocotyl (gure 3A)
and radicle (gure 3B), dry biomass
accumulation did not show any
statistically signicant difference
among groups upon inoculation with
isolated antagonistic strains. It is
important to highlight that seedlings
were analyzed at early stages of
growth; in future experiments,
the impact of these strains on
morphometric characteristic of
later stages of development will be
carried out. Although, there were no
statistically signicant differences
between treatments, a tendency
to increase the dry weight can be
observed in the hypocotyl with
ALAT81 an ALMT74 and in radicle
with ALMH71 and ALMT74.
In terms of radicle length, ALAH51,
ALMR73, ALMT52, ALAT64, ALMH71,
ALMH42, ALAH91 and ALMH92 were
statistically equivalent as compared to
the control. These observations indicate
that the interaction of the mentioned
bacteria strains above did not affect
radicle growth during early seedling
development. However, the rest of the
isolated strains tested had negative
effects, some of them at higher extend
like ALMT73 and ALAT81. On the
other hand, hypocotyl length did not
show statistically signicant difference
of any of the treatments as compared to
the control (table 4).
Further experimentations will be
carried out to nd out if these Bacillus
species strains show antagonistic
activities against other important
phytopathogens if they have an impact
on basil growth and quality in terms
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Asimismo, la acumulación de
biomasa seca en hipocótilo (gura 3A) y
radícula (gura 3B), no mostró ninguna
diferencia estadísticamente signicativa
entre los grupos tras la inoculación
con cepas antagonistas aisladas. Es
importante resaltar que las plántulas
se analizaron en etapas tempranas de
crecimiento; en experimentos futuros, se
llevará a cabo el impacto de estas cepas
en las características morfométricas de
Figura 2. Porcentaje de germinación total de plántulas de albahaca
tratadas con la bacteria aislada de albahaca que presentó
actividad antagonista contra Aspergillus spp. después de
la incubación durante 5 días a 25 ± 1 °C, 80 % de humedad y
en la oscuridad. Los valores presentados son media ± desviación
estándar. No se observó diferencia estadísticamente signicativa entre
tratamientos p > 0,05.
Figure 2. Total germination percentage of basil seedlings treated with
the isolated bacteria from basil that presented antagonistic
activity against Aspergillus spp. after incubation for 5 days at
25
±
1 °C, 80 % humidity and in the dark. Values presented are mean
± standard deviation. No statistically signicant difference among
treatments was observed p > 0.05.
of essential oil and other desirable
traits. Moreover, these strains could
be used for inoculation of other plants
to investigate their biotechnological
potential.
Conclusion
To our knowledge this is the
rst time that B. amyloliquefaciens
strains have been isolated from basil
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etapas posteriores de desarrollo. Si bien
no hubo diferencias estadísticamente
signicativas entre tratamientos,
se puede observar una tendencia a
aumentar el peso seco en el hipocótilo
con ALAT81 y ALMT74 y en la radícula
con ALMH71 y ALMT74.
Figura 3. Acumulación promedio de biomasa seca de hipocótilo (A)
y radícula (B) por plántula de albahaca cultivada después
de la inoculación de las semillas con las bacterias aisladas
e incubadas durante 5 días a 25 ± 1 ° C, 80 % de humedad y
en la oscuridad. Los valores presentados son media ± desviación
estándar. No se observó diferencia estadísticamente signicativa entre
tratamientos p > 0,05.
Figure 3. Average hypocotyl (A) and radicle (B) dry biomass accumulation
per basil seedling grown after seeds inoculation with the
isolated bacteria and incubated for 5 days at 25 ± 1 °C, 80 %
humidity and in the dark. Values presented are mean ± standard
deviation. No statistically signicant difference among treatments was
observed p > 0.05.
En términos de longitud de
radícula, ALAH51, ALMR73, ALMT52,
ALAT64, ALMH71, ALMH42, ALAH91
y ALMH92 fueron estadísticamente
equivalentes en comparación con el
control. Estas observaciones indican que
la interacción de las cepas de bacterias
cultivars. The biotechnological use of
these bacteria to protect basil plants
against fungi is a sustainable and
reliable option to reduce crop loss due
to fungi incidence. Furthermore, these
bacteria are remarkable allies for basil
plant development due to their ability
to colonize them without damage. The
investigation carried out and presented
here in establishes the basis for further
studies on agronomic useful these
Bacillus strains that are naturally
occurring in basil plants around La Paz,
Baja California Sur, Mexico, where we
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mencionadas anteriormente no afectó
el crecimiento de la radícula durante el
desarrollo temprano de las plántulas. Sin
embargo, el resto de las cepas aisladas
ensayadas tuvieron efectos negativos,
algunos de ellos en mayor extensión
como ALMT73 y ALAT81. Por otro lado,
la longitud del hipocótilo no mostró una
diferencia estadísticamente signicativa
de ninguno de los tratamientos en
comparación con el control (tabla 4).
Cuadro 3. Longitudes de radícula e hipocótilo de plántulas de albahaca
de 5 días tratadas con la bacteria aislada que presentó actividad
antagonista contra Aspergillus spp. incubados a 25 ± 1 °C, 80 %
de humedad y en la oscuridad.
Table 3. Radicle and hypocotyl lengths of 5-day old basil seedlings treated
with the isolated bacteria that presented antagonistic activity
against Aspergillus spp. incubated at 25 ± 1 °C, 80 % humidity
and in the dark.
Treatment
Average length (mm)
Radicle Hypocotyl
Control 19.43
a
± 8.68 13.25
abcde
± 4.26
ALAR53 15.10
cde
± 7.71 12.08
cde
± 5.14
ALAH51 19.17
ab
± 8.48 11.61
de
± 4.01
ALMH42 16.50
abcde
± 8.08 10.92
e
± 4.45
ALMR73 18.56
abc
± 8.88 13.65
abcd
± 5.32
ALMT73 10.99
f
± 5.49 12.38
cde
± 4.49
ALAH71 13.92
def
± 6.31 14.66
ab
± 5.09
ALMH71 16.85
abcde
± 7.34 14.98
a
± 4.44
ALAT82 15.27
cde
± 7.22 13.80
abcd
± 4.55
ALAT81 10.19
f
± 4.48 12.31
cde
± 4.28
ALAH91 16.42
abcde
± 8.83 13.79
abcd
± 5.17
ALMH92 15.58
abcde
± 7.22 14.19
abc
± 3.94
ALAT64 16.97
abcde
± 9.14 12.62
abcde
± 3.85
ALAT75 15.35
bcde
± 9.29 12.58
bcde
± 4.88
ALMT74 13.07
ef
± 7.33 12.98
abcde
± 6.06
ALMT52 17.10
abcd
± 7.59 14.77
ab
± 4.90
a, b, c, d, e
Valores presentados son la media ± desviación estándar. Una letra diferente en la misma
columna representa una diferencia estadísticamente signicativa p ≤ 0,05
a, b, c, d, e
Values presented are mean ± standard deviation. Different letter at the same column
represents statistically signicant difference p ≤ 0.05.
can nd very distinctive environmental
conditions like extreme temperatures,
high soil salinity and drought.
Acknowledgments
This work was supported by
the Department of Agronomy at
the Universidad Autónoma de Baja
California Sur. Authors are thankful
to Yozitlali Villavicencio-Velázquez
931
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En futuros experimentos se
ensayará si estas cepas de especies
de Bacillus muestran actividades
antagónicas contra otros topatógenos
importantes si tienen un impacto en el
crecimiento y la calidad de la albahaca
en términos de aceite esencial y otros
rasgos deseables. Además, estas cepas
podrían usarse para la inoculación
de otras plantas para investigar su
potencial biotecnológico.
Conclusión
Hasta donde sabemos, esta es la
primera vez que se han aislado cepas de
B. amyloliquefaciens de cultivares de
albahaca. El uso biotecnológico de estas
bacterias para proteger las plantas
de albahaca contra los hongos es una
opción sostenible y conable para
reducir la pérdida de cultivos debido a
la incidencia de hongos. Además, estas
bacterias son aliadas notables para el
desarrollo de las plantas de albahaca
debido a su capacidad para colonizarlas
sin dañarlas. La investigación realizada
y presentada aquí sienta las bases
para futuros estudios sobre la utilidad
agronómica de estas cepas de Bacillus
que se encuentran naturalmente en
plantas de albahaca alrededor de La
Paz, Baja California Sur, México,
donde se pueden encontrar condiciones
ambientales muy distintivas como
temperaturas extremas, altas
temperaturas. salinidad del suelo y
sequía.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por el
Departamento de Agronomía de
la Universidad Autónoma de Baja
California Sur. Los autores agradecen
a Yozitlali Villavicencio-Velázquez y
José Enrique Amador-Sánchez por el
apoyo técnico.
Literatura citada
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